甘藍(lán)型油菜及其親本物種TTG1和TT18基因家族的克隆與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、甘藍(lán)型油菜是世界上種植最廣泛的油料作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也占有重要地位，傳統(tǒng)的甘藍(lán)型黑籽油菜具有抗病蟲、抗倒伏、油菜籽產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。但其籽粒的含油量偏低，芥酸、硫代葡萄糖甙、多酚類物質(zhì)以及色素等含量偏高。榨出的油色澤深，烹調(diào)時(shí)油煙多，而且芥酸不易被人體消化吸收，營養(yǎng)價(jià)值低，餅粕中的硫代葡萄糖甙的水解產(chǎn)物對牲畜有毒。因此，提高甘藍(lán)型油菜籽粒的含油量，降低菜油中的芥酸、硫代葡萄糖甙、多酚類物質(zhì)以及色素等的含量，改善菜籽油的品質(zhì)，是油菜育

2、種的重要目標(biāo)。本研究克隆了甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜TTG1和TT18基因家族的全長序列，對序列進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和功能比較基因組學(xué)分析，對3個(gè)物種的黑、黃籽材料間TTG1，TT18表達(dá)差異進(jìn)行了研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴采用RACE技術(shù)，克隆了甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜TTG1基因家族各2個(gè)成員的全長cDNA和對應(yīng)的全長基因組序列。甘藍(lán)犁油菜BnTTG1—1、BnTTG1—2的全長基因組序列分別為1511bp、1

3、555bp，典型的全長mRNA[不計(jì)Ploy(A)尾巴，下同]分別為1355bp和1303bp。甘藍(lán)BoTTG—2的全長基因組序列為1594bp，BoTTG1—1、BoTTG1—2的典型全長mRNA分別為1355bp和1404bp。白菜BrTTG1—1、BrTTG1—2的全長基因組序列分別為1656bp、1541bp，它們典型的全長mRNA分別為1478bp和1364bp。
　　 ⑵推導(dǎo)的BnTTG1—1、BnTTG1—2、Bo

4、TTG1—1、BoTTG1—2、BrTTG1—1、BrTTG1—2蛋白均為337個(gè)氨基酸殘基，分子量(Mw)分別為37.28、37.26、37.27、37.31、37.28和37.20kD，等電點(diǎn)(pI)均為4.66，都為酸性蛋白。它們均以絲氨酸最豐富，酸性氨基酸多于堿性氨基酸。用NetPhos2.0預(yù)測它們都存在較多的潛在磷酸化位點(diǎn)，BnTTG1—1、BoTTG1—1和BrTTG1—1都有26個(gè)，BnTTG1—2和BrTTG1—2均有

5、25個(gè)，BoTTG1—2有27個(gè)。所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調(diào)節(jié)。均沒有預(yù)測到它們存在信號肽和跨膜域，預(yù)測它們均可能定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。用SOPMA對蕓薹屬TTG1家族蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測表明，各TTG1蛋白成員的二級結(jié)構(gòu)非常相似，主要由延伸鏈(Extended strand)和隨機(jī)卷曲(Random coil)構(gòu)成，其中隨機(jī)卷曲所占比例最高，β轉(zhuǎn)角(Beta turn)不足10％，α螺旋很少。蕓薹屬TTG1蛋白和AtTTG1蛋白二級

6、結(jié)構(gòu)很相似，整個(gè)分子分布大量的隨機(jī)卷曲。未能預(yù)測出這些蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。
　　 ⑶BnTTG1—1和BrTTG1—2之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到97.2和99％。BnTTG1—2和BoTTG1—1之間也具有極高的同源性，mRNA核苷酸序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到98.7％和98.3％。此外，從內(nèi)含子的一致性、5’UTR中的AG重復(fù)序列的位置與長度、基因序列中的特征性變異堿基、氨基酸序列中的特征

7、性變異氨基酸等方面，都表明BnTTG1—1對應(yīng)于BrTTG1—2，BnTTG1—2對應(yīng)于BoTTG1—1，說明甘藍(lán)和白菜的確為甘藍(lán)型油菜提供了遺傳物質(zhì)。本研究從功能基因家族成員的全長序列比較克隆的角度，為揭示甘藍(lán)型油菜與其親本物種間的進(jìn)化關(guān)系提供了直觀而具體的分子證據(jù)。
　　 ⑷TTG1蛋白在蛋白水平具有極度保守性。蕓薹屬TTG1基因在基因組水平以及編碼區(qū)有一定的差異，但是他們在蛋白水平上有著非常高的同源性，一致性為98.50％

8、～100％，相似性為99.1％～100％。同時(shí)它們與AtTTG1也具有很高的同源性，一致性為92.4％～93.0％，相似性為95.04％～95.9％。蕓薹屬TTG1基因與單子葉植物也具有很高的同源性，甚至與人和動(dòng)物的相應(yīng)蛋白也具有很高的同源性，尤其是在蛋白的中段以及C端十分保守，這一保守性主要表現(xiàn)在物種間編碼區(qū)的高度保守性以及相似氨基酸的取代。這種趨勢主要在看家基因以及一些重要的結(jié)構(gòu)基因中發(fā)現(xiàn)，而轉(zhuǎn)錄因子的分化一般比結(jié)構(gòu)基因快。雖然TT

9、G1基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，但它的保守性甚至超過了一些結(jié)構(gòu)基因。
　　 ⑸采用RACE技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜TT18基因家族5、2、3個(gè)成員的全長cDNA和對應(yīng)的全長基因組序列。甘藍(lán)型油菜BnTT18—1、BnTT18—2、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5的全長基因組序列分別為1875bp、1508bp、1897bp、1972b、1491bpp，典型的全長mRNA(不計(jì)Ploy(A)尾巴，下同)分別

10、為1481bp、1421bp、1477bp、1279bp、1404bp。甘藍(lán)BoTT18—1、BoTT18—2的全長基因組序列分別為1923bp、1491bp，典型的全長mRNA分別為1482bp、1404bp。
　　 ⑹推導(dǎo)的BnTT18—1、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5、BoTT18—1、BoTT18—2、BrTT18—1、BrTT18—2、BrTT18—3編碼337～338個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量

11、(Mw)分別為40.86、40.86、40.83、40.89、、40.86、40.86、40.84、40.87、40.77、40.86kD，等電點(diǎn)(pI)為5.13～5.30，都為酸性蛋白，均以谷氨酸最豐富，酸性氨基酸多于堿性氨基酸。用NetPhos2.0預(yù)測它們都存在較多的潛在磷酸化位點(diǎn)，BnTT18—1、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5、BoTT18—1、BoTT18—2、BrTT18—1、BrTT18—2、Br

12、TT18—3的位點(diǎn)數(shù)分別為10、13、12、7、10、7、13、7、7，所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調(diào)節(jié)。它們均沒有預(yù)測到信號肽和跨膜域，預(yù)測它們均可能定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
　　 ⑺BnTT18—1與BoTT18—1之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到97.5％和99.0％。BnTT18—2與BrTT18—2之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到95.3％和95.6％。BnTT18—

13、3與BrTT18—1之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到99.3％和99.0％。BnTT18—5與BrTT18—3之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達(dá)到100％和100％。其種間基因的一致性高于甘藍(lán)型油菜種內(nèi)成員之間的一致性。因此，BnTT18—1來自于甘藍(lán)的BoTT18—1，BnTT18—2來自于白菜的BrTT18—2，BnTT18—3來自于白菜的BrTT18—1，BnTT18—5來自于白