甘藍(lán)型油菜編碼WIP-鋅指蛋白的TT1基因家族的克隆及在黃、黑籽之間的差異表達(dá).pdf

1、本文克隆了甘藍(lán)型油菜TTl基因家族(BnTTl)2個(gè)成員的全長(zhǎng)cDNA及其基因組序列，進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析及表達(dá)檢測(cè)，構(gòu)建了反義植物表達(dá)載體。主要研究結(jié)論為： 1．首次克隆了甘藍(lán)型油菜BnTTl基因家族2個(gè)成員的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列。 設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RACE反應(yīng)，得到BnTTl基因家族成員的5'和3'cDNA末端，然后擴(kuò)增出2條與AtTTl對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA序列和基因組序列，命名為BnTTl-1和BnlTl-

2、2，基因組序列分別為1919bp和1798bp，均由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成，內(nèi)含子分別為873bp和785bp。 Southern雜交顯示，甘藍(lán)型油菜中可能存在3個(gè)以上的．BnlTl基因家族成員，在．BnTTl-1和BnTTl-2的基礎(chǔ)上，可能還有1個(gè)以上的基因成員未克隆出來。 這是首次在甘藍(lán)型油菜中克隆編碼調(diào)控種皮發(fā)育和種皮色素合成與積累的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的基因。 2．BnTTl-1和BnITl-2具有

3、復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)和順式調(diào)節(jié)方式BnTTl-1和BnTTl-2均有多種mRNA形式，最長(zhǎng)的一種分別為1047bp和1013bp，均存在豐富的5'UTR長(zhǎng)度和3'UTR長(zhǎng)度的多態(tài)性。 BnTTl-1和BnTTl-2的3'UTR中分別有4種和2種不同的poly(A)加尾位置。選擇性poly(A)加尾位置導(dǎo)致了BnTTl-1和BnITl-2的3’UTR的長(zhǎng)度多態(tài)性。 BnTTl-1和BnTTl-2各有3種不同的mRNA起

4、始?jí)A基位置，不僅影響了5’UTR的位置和長(zhǎng)度，也直接影響了ORF的大小和所編碼蛋白的N端序列的長(zhǎng)短。BnTTl-1和BnTFl-2以A<,1>作為起始?jí)A基的mRNA的5'UTR中均嵌有一個(gè)ATG，起始密碼子均向5'上游移動(dòng)了39bp，ORF均延長(zhǎng)為903bp，所編碼蛋白在N末端均增加了13個(gè)氨基酸“MFSSLSNYCSPHS”。 BnlW-1和BnITl-2基因的5'編碼區(qū)中相對(duì)于AtTTl發(fā)生了3處寡核酸缺失，它們?cè)谶@3處分

5、別比AtTTl缺失了4、2和9個(gè)氨基酸。 這種在同一個(gè)基因家族的兩個(gè)成員中同時(shí)存在的選擇性O(shè)RF長(zhǎng)度、選擇性轉(zhuǎn)錄起始位置和選擇性poly(A)加尾位置的現(xiàn)象，在已報(bào)道的基因中，是極為罕見的。 此外，在BnTTl-1和BnTTl-2基因的5’UTR、3UTR和內(nèi)含子區(qū)，分別鑒定了1個(gè)高度保守區(qū)，它們也許同樣參與了基因表達(dá)的調(diào)控。 3．BnTTl-1和BnTTl-2是AtlTl在甘藍(lán)型油菜中的對(duì)應(yīng)基因BnTTl-1

6、和BnTTl-2基因組序列的一致性為91.5％，它們?cè)诎被崴降囊恢滦詾?5.0％，相似性為96.7％，比核苷酸水平的一致性更高。 BnTTl-1和Bnl7l-2與來自擬南芥TTl基因(AtTTl)具有最高水平的同源性，基因組水平的一致性分別為64.9％和65.8％，ORF的一致性分別為80.6％和80.4％，氨基酸水平的一致性分別為76.3％和76.0％。 BnTTl-1和BnTTl-2的核酸序列與擬南芥TTl以

7、外的WIP基因有較低的一致性，而與其它基因缺乏顯著一致性。 聚類分析表明，BnTrl-1和BnTrl-2首先與AtTTl聚在一起，距離很近，然后與大豆GmWIPl聚為一個(gè)類型。該類型與其它WIP蛋白的距離相對(duì)較近，而與非WIP蛋白的距離則很遠(yuǎn)。 　　以上結(jié)果說明，BnTTl-1和BnTTl-2 AtTTl在甘藍(lán)型油菜中的對(duì)應(yīng)基因。 4.BnTTl-1和BnTTl-2與AtTTl一樣，是典型的WIP鋅指蛋白和AtTFl一

8、樣，BnTrl-1和BnTTl-2是核定位蛋白，具有和AtTTl中位置和序列完全一樣的WIP特征性基序、N端富絲氨酸區(qū)、第一個(gè)鋅指域C<,2>H<,2>，以及高度相似的第二個(gè)鋅指域C<,2>HC。 BnTrl-1和BnTTl-2具有多處預(yù)測(cè)顯著的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，也許靠磷酸化作用是它們的翻譯后修飾或活性轉(zhuǎn)換機(jī)制。 BnTl-1和BnTTl-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)中隨機(jī)卷曲最多(47.67％和49.67％)，其次是延

9、伸鏈(23.33％和 21.67％)，a-螺旋(18.67％和19.00％)和B-轉(zhuǎn)角(10.33％和9.67％)也有一定比例，符合鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征。 總之，BnTTl-1和BnTrl-2是與擬南芥AtTrl高度相似的定位于細(xì)胞核的WIP亞類的C<,2>H<,2>型鋅指蛋白，可能是象AtTTl一樣的調(diào)控內(nèi)種皮發(fā)育與種皮色素合成與積累的轉(zhuǎn)錄因子。 5.BnTTl的表達(dá)特征與AtTTl相似，且在黑籽、黃籽系問差異表

10、達(dá)半定量RT-PCR表明，BnTTl-1和BnTTl-2的表達(dá)與AtTTl很相似，表達(dá)水平很低，并具有很強(qiáng)的時(shí)空特異性，主要在花和種子中表達(dá)。 近等基因黑籽系L1和黃籽系L2之間，花中BnTTl-1和BnTTl-2的表達(dá)水平并沒有差異，但是L2的花后10天的幼種中這兩個(gè)基因的表達(dá)水平極顯著地低于L1。這可能說明TTl基因的表達(dá)下調(diào)是形成L2黃籽的一個(gè)重要原因。 6.構(gòu)建了BnTTl基因家族反義植物表達(dá)載體。 采用