玉米CMS-S育性相關(guān)線粒體蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、由線粒體遺傳物質(zhì)間重組產(chǎn)生的嵌合基因與很多植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)，位于線粒體呼吸或ATP酶復(fù)合體亞基基因的側(cè)翼區(qū)的嵌合基因往往與之協(xié)同表達(dá)，一方面可以通過(guò)自身的表達(dá)產(chǎn)物干擾線粒體的正常功能，另一方面還可以通過(guò)與這些毗連的功能基因共轉(zhuǎn)錄而影響其mRNA的剪切和翻譯過(guò)程，從而使花粉或花器官發(fā)育不正常。在玉米CMS-S中，由重組產(chǎn)生的orf355和orf77位于coxⅠ和coxⅡ的下游，本課題以Mol7rf3rf3為研究材料，CMS-S育性相

2、關(guān)基因orf355、orf77為研究對(duì)象，通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、原核表達(dá)、洋蔥瞬時(shí)表達(dá)來(lái)進(jìn)行研究，獲得以下結(jié)果：
　　 1.利用ConPredⅡ和ExPASyProteomicsServer對(duì)orf77和orf355的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，可知ORF77有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，ORF355有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，N端都在細(xì)胞膜的外側(cè)，具有很強(qiáng)的疏水性。
　　 2.將orf17、orf60、orf77、orf355分別克隆到原核表達(dá)載體

3、pET-28a中，設(shè)置疏水性的atp9為對(duì)照，待大腸桿菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測(cè)定生長(zhǎng)曲線，在SDS-PAGE上檢測(cè)不到外源片段的表達(dá)，只有含pET-28a-orf355的菌株生長(zhǎng)曲線下降，而含其它質(zhì)粒的菌株生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，說(shuō)明pET-28a可以表達(dá)疏水性蛋白，orf355的表達(dá)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，不是因ORF355的疏水性而是其潛在的毒性。
　　 3.將orf17、orf60、or77、orf

4、355分別克隆到原核表達(dá)載體pTYB11中，待大腸桿菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測(cè)定生長(zhǎng)曲線，在SDS-PAGE上檢測(cè)不到orf355蛋白的表達(dá)，且只有含pTYB11-orf355的菌株生長(zhǎng)曲線下降，而含其它質(zhì)粒的菌株生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，說(shuō)明orf355的表達(dá)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，ORF355可能是一種毒性蛋白。
　　 4.在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建pET-28a-EGFP的基礎(chǔ)上，將orf17、orf60

5、、orf77、orf355克隆到EGFP的C端，待大腸桿菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測(cè)定生長(zhǎng)曲線，在SDS-PAGE上檢測(cè)不到orf355的融合蛋白的表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察，與對(duì)照質(zhì)粒pET-28a-EGFP及未誘導(dǎo)的菌體相比，只有含pET-28a-EGFP-orf355的菌株熒光變?nèi)?，說(shuō)明orf355的表達(dá)對(duì)EGFP的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生影響，同時(shí)生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示只有含pET-28a-EGFP-orf355的菌株生

6、長(zhǎng)受到抑制，以上結(jié)果表明ORF355可能是一種毒性蛋白。
　　 5.構(gòu)建pET-28a-egfp載體，將orf77、of355克隆到EGFP的N端，待大腸桿菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期（OD600=0.5），誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并測(cè)定生長(zhǎng)曲線，與對(duì)照質(zhì)粒pET-28a及未加誘導(dǎo)劑的陰性對(duì)照相比，只有含pET-28a-orf355-egfp的菌株生長(zhǎng)受到抑制，而含pET-28a-orf77-egfp的菌株生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響。在熒光顯微鏡下觀察，與對(duì)照

7、質(zhì)粒pET-28a-egfp及未誘導(dǎo)的菌體相比，含pET-28a-orf77-egfp的菌株產(chǎn)生微弱的熒光，而含pET-28a-orf355-egfp的菌株沒(méi)有熒光，與結(jié)果4-致，說(shuō)明ORF355可能是一種毒性蛋白。
　　 6.洋蔥瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果顯示orf77和orf355能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，ORF77出現(xiàn)在洋蔥的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，ORF355出現(xiàn)在洋蔥的細(xì)胞膜上，這說(shuō)明了外源蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的部位。
　　 7.總結(jié)：線