玉米S-CMS雄性不育相關(guān)基因的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究.pdf

1、玉米的CMS可劃分為T、C、S三種類型，其中S型CMS為配子體雄性不育類型，其胞質(zhì)不育基因被認為與線粒體中的orf355和orf77相關(guān)(Zabala，1997)。人們研究發(fā)現(xiàn)orf355和orf77在不育花粉中被共轉(zhuǎn)錄為兩個轉(zhuǎn)錄本，而這兩個轉(zhuǎn)錄本的豐度在育性恢復(fù)的花粉中卻大大降低(肖海林，2006)，在orf77翻譯過程中由于orf77經(jīng)過RNA編輯提前產(chǎn)生終止密碼子，使得orf77的蛋白質(zhì)產(chǎn)物理論上成為一個只有17個氨基酸的多肽(G

2、allagheretal.,2002)，這個多肽與ATP9的C端穿膜結(jié)構(gòu)域有很高的同源性，人們推測它可能會結(jié)合到線粒體內(nèi)膜上導(dǎo)致膜滲透性的失常而啟動PCD過程，或者干擾ATP9的正常功能而使線粒體的呼吸鏈出現(xiàn)異常，由于能量供應(yīng)不足而啟動PCD過程，從而引起花粉敗育。 本課題以S-CMS雄性不育相關(guān)基因orf355和orf77為研究對象，通過結(jié)構(gòu)預(yù)測、原核表達、洋蔥表皮定位、蛋白質(zhì)雙向電泳等來進行研究，獲得的主要結(jié)果如下：

3、 1.利用軟件TMHMMServerv.2.0對orf77和orf355的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，可知orf77和orf355的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有穿膜結(jié)構(gòu)域，具有很強的疏水性。 2.利用DpnI介導(dǎo)的定點誘變使orf77突變成orf17，接著分別把orf17、orf60、orf77轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達載體pET-15b中，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達測定菌液濃度做生長曲線，發(fā)現(xiàn)pET-15b-orf77中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達后生長曲線有下降的過程，pET

4、-15b-orf17和pET-15b-orf60中無變化，說明了完整的orf77產(chǎn)物具有毒性。 3.把orf77和orf355分別轉(zhuǎn)入到原核表達載體pET-28a、pET-32a、pEGX-KG、pTYB-12中均得不到其目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。體外直接合成orf17短肽未成功，利用體外轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)也未得到orf77的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 4.把EGFP轉(zhuǎn)入到表達載體pET-28a中，誘導(dǎo)表達可得到EGFP的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在熒光顯微鏡

5、下觀察有強烈熒光產(chǎn)生；在pET-28a-EGFP中分別轉(zhuǎn)入orf77和orf355誘導(dǎo)表達后熒光十分微弱，這就顯示了轉(zhuǎn)入orf77和orf355后能夠明顯阻礙EGFP的翻譯。 5.抽提pET-28a-EGFP-orf77和pET-28a-EGFP-orf355大腸桿菌RNA，做RT-PCR。結(jié)果顯示，各時期均存在orf77、orf355的轉(zhuǎn)錄本，且誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄本的量有了明顯提高，可知orf77和orf355在融合表達過程中轉(zhuǎn)錄正常

6、。 6.抽提pET-28a-EGFP和pET-28a-EGFP-orf77大腸桿菌總蛋白進行雙向電泳，觀察分析發(fā)現(xiàn)前者比后者總蛋白點數(shù)多，選取pET-28a-EGFP與pET-28a-EGFP-orf77存在顯著性差異的9個點進行質(zhì)譜檢測，結(jié)果顯示這9個點中有8個代謝活動相關(guān)，1個與細胞骨架系統(tǒng)形成相關(guān)。 7.對orf77和orf355進行洋蔥表皮定位，不僅顯示了orf77和orf355最終定位在細胞膜，更證明了orf7