豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細(xì)胞的膜泡運輸機制的研究.pdf

1、PRRSV是正鏈帶囊膜的RNA病毒，PRRSV感染先與易感細(xì)胞表面硫酸乙酞肝素結(jié)合發(fā)生吸附，隨后與唾液酸粘附素的結(jié)合引發(fā)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞形成內(nèi)體小泡。內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后PRRSV需要解聚將其基因組釋放并進(jìn)入細(xì)胞漿才能產(chǎn)生感染性病毒粒子。在此過程中除了清道夫受體CD163和pH的降低等因素外，一些蛋白酶活性的分子也是PRRSV感染侵入所必須的。然而相對于PRRSV的吸附內(nèi)吞過程，PRRSV借助何種膜泡運輸機制最終突破囊膜屏障釋放其基因

2、組進(jìn)入細(xì)胞漿還一無所知。目前大多數(shù)病毒，包括PRRSV，在感染宿主細(xì)胞的過程中是通過特異性的吸附在細(xì)胞表面而被細(xì)胞以“主動胞飲”的方式內(nèi)吞，然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要分選站早期內(nèi)含體，之后走向經(jīng)典的內(nèi)吞-溶酶體途徑，或循環(huán)內(nèi)含體膜泡轉(zhuǎn)運途徑。然而許多病毒在進(jìn)入內(nèi)吞-溶酶體死亡途徑前在內(nèi)膜系統(tǒng)中pH、離子濃度等因素作用下引發(fā)病毒穿刺進(jìn)入細(xì)胞漿產(chǎn)生感染性病毒粒子。
　　 Rab蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膜泡運輸?shù)木哂蠫TP酶活性的開關(guān)分子，同時也是作

3、為各內(nèi)含體膜泡的標(biāo)志性蛋白，已廣泛用于定位細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)含體膜泡的研究，如Rab5定位早期內(nèi)含體、Rab7定位晚期內(nèi)含體、Rab11定位近核循環(huán)內(nèi)含體。因此我們以Rab蛋白與PRRSV的共定位實驗結(jié)合Rab蛋白負(fù)調(diào)控突變體對PRRSV感染的抑制試驗確定PRRSV內(nèi)吞后膜泡運輸途徑，DsRED-Rab5/7/11與PRRSV的共定位實驗結(jié)果顯示PRRSV能與Rab5/7共定位，另外Rab5/7蛋白負(fù)調(diào)控突變體實驗也顯示Rab5/7負(fù)調(diào)控突變

4、體能明顯抑制PRRSV感染，抑制效果分別為70％、30％-80％,因此PRRSV感染依賴于早期內(nèi)含體和晚期內(nèi)含體的膜泡運輸，而近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸與PRRSV感染無關(guān)。
　　 另外與囊泡運輸相關(guān)的PI3K途徑（磷脂酰肌醇激酶途徑），通過與Rab5互作共同調(diào)節(jié)早期內(nèi)含體的膜泡運輸與融合，為了更好的解析PRRSV感染過程中的早期內(nèi)含體膜泡運輸過程，我們以PI3K的抑制劑LY294002干擾細(xì)胞早期內(nèi)含體膜泡運輸過程來確定其在PRR

5、SV感染中的作用，結(jié)果表明LY294002對PRRSV在Marc-145中的感染無明顯抑制作用，因此PRRSV的感染可能通過不依賴于PI3K的非經(jīng)典早期內(nèi)含體膜泡運輸途徑介導(dǎo)。
　　 PKC是另一與囊泡運輸相關(guān)的信號分子，與Rab11共同調(diào)節(jié)近核循環(huán)內(nèi)含體的運輸。同樣為了更好的解析PRRSV感染與近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸?shù)年P(guān)系，我們以PKC的抑制劑bisindolylmaleimide(BIM)I干擾細(xì)胞近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運輸過程