豬繁殖與呼吸綜合征病毒強弱毒感染豬肺泡巨噬細胞差異蛋白的篩選及驗證.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus, PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙為特征的急性傳染病。1987年，該病在美國首次報道。2006年，中國爆發(fā)高致病性PRRS，除了經(jīng)典癥狀以外，以高致病率與高死亡率為主要特點。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬；

2、基因組在核糖體移碼框的作用下轉(zhuǎn)錄并翻譯為pp1a與pp1ab兩段多肽，并在其自身產(chǎn)生的水解酶的作用下，將這兩條多肽鏈消化產(chǎn)生多于12種非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白會參與結(jié)構(gòu)蛋白的合成，與此同時，產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白會一同協(xié)作，參與病毒感染宿主細胞的過程。PRRSV具有嚴(yán)格的細胞嗜性，在患豬體內(nèi)病毒主要靶細胞是肺泡巨噬細胞（PAM）以及不同組織的單核巨噬細胞，不同毒力的毒株感染 PAM效率有顯著差異，導(dǎo)致這種差異的機制尚不清楚。

3、>　　本研究以高致病性PRRSV HuN4強毒株與其傳代致弱的HuN4-F112弱毒株為參考毒株，構(gòu)建重組EGFP-PRRSV強弱毒感染性克隆，感染和純化PAM，進行定性蛋白質(zhì)譜分析；同時以其親本強弱毒感染宿主PAM細胞膜蛋白進行定量蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗證與病毒相互作用PAM細胞膜差異蛋白，可揭示PRRSV不同毒力毒株感染細胞效率差異的分子基礎(chǔ)，為PRRSV致病機制的研究提供理論依據(jù)。
　　為了純化和篩選與PRRSV相互作用的宿

4、主細胞膜蛋白，本研究首先分別構(gòu)建了含增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的重組PRRSV強弱毒感染性克隆，作為指示病毒，為篩選及驗證與PRRSV相互作用的 PAM細胞膜蛋白提供技術(shù)支撐。以 PRRSV HuN4感染性克隆以及其傳代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆為骨架，利用反向遺傳操作技術(shù)，在其病毒基因組ORF1b和ORF2a之間插入egfp基因，并在外源基因3?端下游插入該病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6（TRS6），構(gòu)建重組病毒感染性分子克隆pH

5、uN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP，并通過轉(zhuǎn)染拯救出重組病毒。在MARC-145細胞中，將重組病毒連續(xù)傳代，其外源egfp基因仍能夠持續(xù)表達，表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組病毒在病毒滴度、噬斑形態(tài)、生長能力等方面與親本毒無明顯差異。
　　在獲得具有能夠持續(xù)表達綠色熒光蛋白的重組PRRSV強弱毒之后，將強弱毒重組病毒分別感染PAM，純化PAM，提取細胞膜蛋白進行定性蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗證與病毒相互作用PAM

6、細胞膜差異蛋白。結(jié)果表明，在分選流式儀的FITC通道中，可獲得強弱重組病毒感染PAM而產(chǎn)生的綠色熒光信號，分選出重組病毒感染的PAM，獲得了純化的細胞膜蛋白，利用Shotgun方法進行了膜蛋白定性蛋白質(zhì)譜分析，獲得的蛋白信息進行GO注釋，并按蛋白分類分析，篩選出強弱毒差異蛋白93個。對選擇的5個相關(guān)蛋白進行標(biāo)簽融合和真核上調(diào)表達試驗，發(fā)現(xiàn)Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和 Kexin ty

7、pe9對強毒存在抑制作用，推測為抵御PRRSV感染的宿主蛋白；Clusterin isoform x1對強毒的感染存在上調(diào)作用，推測可能是PRRSV感染的宿主受體蛋白。
　　以其親本強弱毒感染宿主 PAM細胞膜蛋白進行了定量蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗證了與病毒相互作用PAM細胞膜差異蛋白。結(jié)果表明，通過Label-free定量蛋白質(zhì)組分析，獲得差異蛋白95個，其中確定定位在膜上26個；通過Western Blot驗證了KDEL受體以及