豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細胞激活白細胞介素8的表達的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。2006年夏季我國南方諸省暴發(fā)“豬無名高熱病”，損失嚴重，持續(xù)流行，造成全國十幾個省發(fā)生疫情，其中PRRSV是最主要病原。
　　 細胞因子在病毒免疫和致病方面的作用非常

2、重要。IL－8是1987年Yoshimur發(fā)現(xiàn)的第一個趨化性細胞因子，屬于C-X-C趨化因子超家族中的一個成員。IL－8屬于調節(jié)炎癥的介質，對細菌和病毒感染引發(fā)的炎癥和免疫過程有重要的調節(jié)作用。已有試驗證明豬感染PRRSV后能誘導體內IL－8的產(chǎn)生，但PRRSV誘導IL－8機制并不清楚。鑒于此，開展了PRRSV感染Marc-145細胞誘導IL-8產(chǎn)生的機制的研究，主要內容包括：
　　 1．PRRSV感染Marc-145細胞激活I

3、L-8。
　　 將由白細胞介素8（IL-8）全長啟動子驅動的熒光素酶報告質粒plL-8-luc與熒光內參質粒pRL-TK轉染Marc-145細胞，24h接種PRRSV CH-1a株，經(jīng)熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后3h內能顯著激活IL-8，感染后6h激活倍數(shù)更高，之后逐漸降低。由此PRRSV感染Marc-145細胞以后可以激活IL-8，且感染后6h激活倍數(shù)最高。
　　 2．PRRSV N蛋白和Nsp2蛋白在Marc

4、-145細胞中表達能激活IL-8。
　　 為了確定PRRSV的哪種編碼蛋白參與了誘導IL-8，將編碼PRRSV結構蛋白和非結構蛋白的真核表達質粒分別與pIL-8-luc及pRL-TK共轉染Marc-145細胞，36h后檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)結構蛋白N和非結構蛋白Nsp2能激活IL-8，而其他編碼蛋白則無明顯的激活作用。
　　 3．PRRSVN蛋白和Nsp2蛋白激活IL-8的必需區(qū)域。
　　 N蛋白和Nsp2蛋白在

5、Marc-145細胞中的表達能激活IL-8。為了確定N蛋白和Nsp2蛋白誘導IL-8產(chǎn)生的確切結構域，構建了N蛋白和Nsp2蛋白的缺失突變體真核表達質粒。利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)N蛋白發(fā)揮作用的主要是其30～73位氨基酸區(qū)域，該區(qū)域包含了N蛋白的NLS區(qū)域、NoLS區(qū)域和RNA結合區(qū)：但沒有發(fā)現(xiàn)Nsp2蛋白激活IL-8的特定區(qū)域。
　　 4．PRRSV感染Marc-145細胞激活IL-8信號通路的研究。
　　 為了

6、解PRRSV感染Marc-145細胞誘導IL-8產(chǎn)生的信號通路，將由IL-8全長啟動子驅動的熒光素酶報告質粒pIL-8-luc、由IL-8編碼區(qū)上游133bp的啟動子驅動的熒光素酶報告質粒-133bp-luc、以及在-133bp-luc基礎上分別在NF-κB、AP-1和NF-IL-6轉錄因子結合位點進行位點突變的突變體NF-κBmut-luc、AP-lmut-luc、NF-IL-6mut-luc分別與內參質粒pRL-TK轉染Marc-1

7、45細胞，24h 后接種PRRSV CH-1a株，接毒后6h檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)NF-κBmut-luc、 NF-IL-6mut-luc轉染組感染PRRSV后IL-8沒有明顯激活，而plL-8-luc-133bp-luc及AP-lmut-luc轉染組感染PRRSV后均可以明顯激活IL-8啟動子活性，即NF-κB及NF-IL-6兩個轉錄因子結合位點突變后不能誘導IL-8的表達，說明NF-κB及NF-IL-6兩個轉錄因子對于PRRSV激活