錳中毒致體外培養(yǎng)雞支持-生精細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、錳是一種工業(yè)中廣泛應(yīng)用的金屬，它在體內(nèi)過(guò)量蓄積可導(dǎo)致毒性反應(yīng)，影響機(jī)體正常生理功能。近年來(lái)隨著生殖毒理、生殖生化等領(lǐng)域研究的發(fā)展，錳對(duì)生殖系統(tǒng)的損害已越來(lái)越受到人們的重視。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)錳生殖毒性的研究主要集中于哺乳動(dòng)物，而對(duì)禽類(lèi)幾乎沒(méi)有研究。本試驗(yàn)以雞支持-生精細(xì)胞為研究對(duì)象，在培養(yǎng)體系中分別加入終濃度0、2、3、4mmol·L-1氯化錳（MnCl2），作用24 h，通過(guò)對(duì)雞支持.生精細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞

2、色素C蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)Bak、Bcl-x和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平等方面的檢測(cè)，探討錳誘導(dǎo)雞支持.生精細(xì)胞凋亡的機(jī)理。研究結(jié)果表明：
　　 1應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色，WST-1比色法，二硝基苯肼比色法檢測(cè)MnCl2對(duì)雞支持.生精細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示MnCl2能夠抑制雞支持-生精細(xì)胞活性，破壞支持細(xì)胞貼壁性能和生精細(xì)胞對(duì)支持細(xì)胞的依附性，表明MnCl2對(duì)雞支持.生精細(xì)胞具有毒性作用；
　　 2倒置顯微鏡下觀察雞支

3、持-生精細(xì)胞生長(zhǎng)情況，AO/EB雙熒光染色、透射電鏡觀察不同濃度MnCl2作用下支持-生精細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果表明MnCl2能誘導(dǎo)支持-生精細(xì)胞凋亡，且凋亡率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；應(yīng)用DNA Ladder、TUNEL法檢測(cè)MnCl2對(duì)雞支持-生精細(xì)胞DNA的損傷作用，結(jié)果證實(shí)MnCl2可以造成雞支持.生精細(xì)胞DNA損傷，且呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。提示MnCl2致DNA損傷是其誘導(dǎo)雞支持.生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一；
　　 3應(yīng)用JC-1

4、熒光探針?lè)z測(cè)線(xiàn)粒體膜電位，western bolt檢測(cè)細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)量，試劑盒檢測(cè)Caspase-3，9和線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Bak、Bcl-x和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示MnCl2能導(dǎo)致支持.生精細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低，胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)量增加，Caspase-3，9活性升高，呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ降低，Bak mRNA表達(dá)量增加，Bcl-x和Caspase-3 m