日本沼蝦生精細胞體外生長分化的研究.pdf

1、生精細胞的體外培養(yǎng)是研究生殖發(fā)育的一個重要手段。目前，在哺乳類、兩棲類和魚類方面，通過人為激素調(diào)控，精子體外發(fā)生的研究基本上都實現(xiàn)了精原細胞的增殖分化，精母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成精子細胞的過程。但是精子細胞的完全成熟尚未實現(xiàn)。建立生精細胞體外培養(yǎng)模型有助于研究精子發(fā)生的調(diào)控機制。甲殼類動物精子發(fā)生的體外研究目前報道較少。從動物系統(tǒng)發(fā)育來看，甲殼動物是較早具備獨立和相對完善的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)的，深入了解其內(nèi)分泌和神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)對生殖的影響，對探索

2、高等生物的生殖調(diào)控機制，具有重要參考意義。
　　 另外，外界環(huán)境因素尤其是一些毒性物質(zhì)嚴重影響著種質(zhì)，使種質(zhì)越來越差，制約著水產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展。研究一些毒性物質(zhì)對生精細胞的增殖分化的影響，對于闡明生殖毒性的作用機制，具有理論意義，并對種質(zhì)保護和健康養(yǎng)殖提供重要參考，具有實踐意義。
　　 本實驗以日本沼蝦的生精細胞為培養(yǎng)對象，研究了17α-甲基睪酮、水體Cd2+及促雄腺對日本沼蝦生精細胞體外生長分化的影響。結(jié)果如下：

3、　　 （1）日本沼蝦生精細胞與支持細胞共培養(yǎng)的情況下，通過觀察測定添加不同17α-MT濃度的各組生精細胞的存活率、精子細胞四分體的數(shù)量和棘突長出胞體的精細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)17α-MT不影響生精細胞的存活率，生精細胞體外分化最適宜的17α-MT濃度為1500 ng/mL。
　　 （2）胰酶消化法和差速貼壁法對生精細胞進行分離和純化，用不同濃度的Cd2+對生精細胞進行處理，分別用MTT法檢測細胞體外生長抑制，單細胞凝膠電泳法（彗星試驗

4、）檢測生精細胞的DNA損傷，發(fā)現(xiàn)①0.05％濃度的胰蛋白酶，消化40 min，可以獲得更多的生精細胞；差速貼壁法可以去除部分體細胞和精子。②Cd2+作用后，24 h前，各濃度對細胞均無明顯的增殖抑制；24 h后，5 ng/mL組對細胞無明顯的增殖抑制，50ng/mL、500ng/mL及1000 ng/mL組對細胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制，吸光度值隨Cd2+濃度的升高而降低，即細胞的增殖率與Cd2+濃度呈負相關(guān)。③5 ng/mL、50 ng/

5、mL、500 ng/mL、1000 ng/mL4個實驗濃度均能引起DNA損傷，在24 h就可檢測出DNA受損，且相同作用時間內(nèi)，DNA損傷程度與總損傷細胞數(shù)隨Cd2+濃度的增加而增大；同一濃度的處理組，隨著處理時間的延長，DNA損傷程度與總損傷細胞數(shù)逐漸增大。DNA損傷程度和總損傷細胞數(shù)與Cd2+濃度及時間呈正相關(guān)。
　　 （3）通過促雄腺與生精細胞體外共培養(yǎng)實驗顯示，實驗組出現(xiàn)頂體囊泡和棘突的精子細胞數(shù)量明顯多于對照組，表明促