局部高溫對青春期前大鼠睪丸支持細(xì)胞的影響及其與生精細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、背景:
　　近幾十年來人類的生殖功能不斷退化,男性精子數(shù)量和質(zhì)量有明顯下降趨勢,研究發(fā)現(xiàn),世界成年男性的精子密度在過去50年里下降了近一半,平均每年下降約1％;研究表明,造成其急劇下降的因素與環(huán)境污染加劇有很大關(guān)系;近來,人們對環(huán)境干擾物、生活飲食方式及環(huán)境溫度等對男性生殖功能影響的認(rèn)識日益深入。大量研究證實(shí),隱睪癥患者、長期穿牛仔褲或高溫作業(yè)下的青年男子的生育力出現(xiàn)明顯下降,表明哺乳動(dòng)物睪丸需要一個(gè)比腹腔溫度低的適宜環(huán)境才能正常

2、發(fā)育;溫度作為一種外在因素引起男性不育逐漸受到重視;而當(dāng)前臨床應(yīng)用的男性避孕方法如輸精管結(jié)扎術(shù)等都存在不同程度的副作用,促使研究者尋找更加安全有效的方法,提高睪丸局部溫度作為抗精子發(fā)生的方法則為研究男性避孕提供了一條新思路;但目前對高溫引起的生精障礙機(jī)制研究仍較少。本研究采用高溫處理未成年動(dòng)物睪丸的模型,從細(xì)胞及分子水平探討高溫作用后生精功能障礙的機(jī)理,并對高溫引起不育的機(jī)制進(jìn)行深入研究;這些研究對阻止、延緩或減弱上述因素對人類生育能力

3、的損害有重要意義,同時(shí)也為臨床治療一些男性不育、指導(dǎo)未成年男性生殖保健和探索男性避孕措施的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1)研究高溫對青春期前大鼠睪丸生精細(xì)胞的影響,闡明高溫引起生精障礙的早期機(jī)制;
　　2)探討局部高溫誘導(dǎo)的睪丸支持細(xì)胞波形蛋白表達(dá)與分布改變與生精細(xì)胞凋亡間的關(guān)系,闡明支持細(xì)胞在高溫誘導(dǎo)生精障礙中的作用;
　　3)研究睪丸生精細(xì)胞Caspase-3在高溫作用后的表達(dá)分布情況,闡明Caspa

4、se-3在高溫誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡中的作用,同時(shí)探討其與支持細(xì)胞波形蛋白分布及表達(dá)改變的關(guān)系。
　　材料與方法:
　　健康4~6周齡青春期前雄性 SD大鼠,標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,給以規(guī)律光照(12h:12h)、自由進(jìn)食飲水。將大鼠隨機(jī)分為對照組(8只)和實(shí)驗(yàn)組(32只),實(shí)驗(yàn)組按高溫處理后2、4、12和24小時(shí)均分成4個(gè)亞組(n=8)。通過對睪丸局部高溫(43℃水浴15分鐘)處理,對照組浸于22℃水浴15分鐘于24小時(shí)后處死

5、;分別于處理后各時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死,收集標(biāo)本。采用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法,分析高溫對青春期前 SD大鼠睪丸曲細(xì)精管細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、支持細(xì)胞波形蛋白及生精細(xì)胞 Caspase-3蛋白表達(dá)與分布的影響,采用紫外分光光度法檢測睪丸組織Caspase-3的活性;同時(shí),應(yīng)用Western blot蛋白免疫印跡技術(shù)定量檢測波形蛋白表達(dá)情況;采用 TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測各組的生精細(xì)胞凋亡情況;采用微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測各組睪丸內(nèi)睪酮含量。

6、>　　結(jié)果:
　　1.組織學(xué)觀察與睪酮含量:處理后2 h即可見少量生精細(xì)胞脫落至管腔,4 h組可見大量生精細(xì)胞脫落,生精細(xì)胞與曲細(xì)精管基底膜之間形成較大空隙;12 h組可見管腔脫落細(xì)胞消失,生精上皮變薄,生精細(xì)胞稀疏、排列紊亂,支持細(xì)胞胞質(zhì)呈空泡樣改變;24 h損害較12 h更為嚴(yán)重,多數(shù)管腔可見多核巨細(xì)胞。高溫作用后睪丸內(nèi)睪酮含量在12 h及24 h與對照組比較均減少,其中24 h組明顯下降(P<0.05)。
　　2.生精

7、細(xì)胞凋亡情況:
　　1)TUNEL法檢測:對照組可見睪丸生精上皮排列完整規(guī)則,存在較多的自發(fā)性細(xì)胞凋亡,主要集中在精原細(xì)胞及部分精母細(xì)胞;高溫處理2及4h后凋亡數(shù)與對照組比較反而減少(P<0.01),各組凋亡細(xì)胞主要定位在初級精母細(xì)胞及精原細(xì)胞;12 h組生精細(xì)胞凋亡主要集中在生精周期的Ⅰ~Ⅳ期(早期)和Ⅻ~ⅩⅣ期(晚期),而Ⅴ~Ⅶ期(中期)凋亡少見;24 h組見大部分曲細(xì)精管均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,數(shù)目明顯增多;12 h及24 h組凋亡

8、指數(shù)與對照組比較明顯增加(P<0.01)。
　　2)流式細(xì)胞儀檢測:對照組可見凋亡峰,高溫處理后2及4 h凋亡峰反較對照組下降,而在高溫處理后12及24 h組,凋亡峰明顯升高,甚至成為主峰;高溫處理后2及4 h組亞單倍體細(xì)胞百分率與對照組比較降低(P<0.05),而12及24 h組與對照組比較明顯升高(P<0.01)(Control:10.41±1.91,2 h:7.64±2.78,4 h:7.40±3.25,12 h:20.46

9、±5.13,24 h:30.98±9.96)。且12及24 h組4C峰較前幾組降低比較明顯(P<0.01),2C峰變化不明顯,1C峰逐漸降低。
　　3.波形蛋白(Vimentin)表達(dá)與分布情況:
　　1)免疫組化:對照組波形蛋染色可見陽性沿基底膜形成棕色的環(huán),并隨支持細(xì)胞胞質(zhì)呈輻射狀伸向管腔;2h組可見其圍繞支持細(xì)胞核周表達(dá),與對照組比較伸至管腔的波形蛋白微絲表達(dá)減少或消失;圖像分析顯示,2 h組與對照組比較蛋白表達(dá)無明顯

10、差異,而12及24 h組與對照組比較差異顯著(P<0.01),4 h組較2 h組蛋白表達(dá)增加(P<0.01),4 h組與12 h組及24 h組與12 h組間蛋白表達(dá)比較無差異。
　　2)Western blot免疫印跡法:2 h組與對照組比較蛋白表達(dá)無明顯差異,4 h組較對照組蛋白表達(dá)增加(P<0.05),而12及24 h組與對照組比較差異顯著(P<0.01);顯示各組波形蛋白表達(dá)量與免疫組織化學(xué)所得結(jié)果基本相符。
　　4.

11、 Caspase-3蛋白表達(dá)與分布及活性變化情況:高溫處理后在2及4 h均可見表達(dá),陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多,這時(shí)仍見大多數(shù)表達(dá)在胞漿內(nèi),主要集中在精母細(xì)胞表達(dá),在脫落于管腔中的精子細(xì)胞核周也可見其表達(dá);至高溫處理后12及24 h,在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的胞核出現(xiàn)Caspase-3強(qiáng)陽性表達(dá),圖像分析顯示:除2 h組與對照組比較染色陽性細(xì)胞 Caspase-3含量無差別外,其它各組均升高(P<0.05);高溫處理各組陽性細(xì)胞表達(dá)率與對照組比較均

12、增多(P<0.01),同時(shí)活性檢測結(jié)果與上述基本相符。
　　結(jié)論:
　　1.高溫作用可在短期內(nèi)引起青春期前大鼠生精過程損傷,生精細(xì)胞凋亡增加可能是造成這種損傷的機(jī)制之一。
　　2.支持細(xì)胞波形蛋白對維持生精上皮結(jié)構(gòu)的完整性有重要作用;高溫可能通過直接作用支持細(xì)胞,造成支持細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)及分布改變進(jìn)而破壞生精過程,可能解釋高溫導(dǎo)致生精障礙的早期機(jī)制。
　　3. Caspase-3表達(dá)及分布的改變可能與支持細(xì)胞波