NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育中的表達(dá)及其與生精細(xì)胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　NDRG2與NDRG1，NDRG3和NDRG4共同組成NDRG家族，該家族成員可能與細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)，但其具體的生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步研究。在前期的研究中我們通過免疫組織化學(xué)染色觀察到NDRG2在成年人和小鼠睪丸內(nèi)均表達(dá)定位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，而在生精細(xì)胞內(nèi)未見明顯的陽性著色，推測其可能參與睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌與調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控精子的發(fā)生，因此本實(shí)驗(yàn)的目的在于探討NDRG2在睪丸發(fā)育與精子發(fā)生過程中的作用及其機(jī)制。

2、r>　　方法：
　　1．利用RT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交及免疫組織化學(xué)等方法對比研究出生后大鼠睪丸發(fā)育不同階段（1、5、15、21、35和75d）中NDRG2的表達(dá)與定位；并分離21、35和75d大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞，利用RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交分析和驗(yàn)證NDRG2在大鼠睪丸不同發(fā)育階段中表達(dá)的差異性。
　　2．建立成年大鼠單劑量MAA（650mg/kg）腹腔注射誘導(dǎo)精母細(xì)胞凋亡模型，采用TUNEL、RT-

3、PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交、免疫組織化學(xué)、間接免疫熒光和激光顯微切割技術(shù)分析NDRG2在生精細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的變化，探討NDRG2與生精細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。
　　3．青春期大鼠睪丸內(nèi)生精細(xì)胞自發(fā)性凋亡達(dá)到頂峰，建立青春期（21d）大鼠隱睪模型，通過TUNEL染色驗(yàn)證該模型、運(yùn)用免疫組織化學(xué)和間接免疫熒光等方法分析NDRG2在隱睪和對照側(cè)睪丸表達(dá)的差異，并且分離術(shù)后不同時間點(diǎn)的間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞，運(yùn)用免疫印跡雜交檢測NDRG2和p

4、53的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1．RT-PCR和Westernblot結(jié)果均顯示NDRG2在出生后1d大鼠睪丸內(nèi)即有表達(dá)，隨后逐漸升高，至青春期達(dá)到頂峰（21和35d），在成年期其表達(dá)反而下降。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NDRG2持續(xù)表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，但在睪丸發(fā)育不同階段，其在生精小管內(nèi)的表達(dá)卻存在明顯的差異。在新生期（1和5d）主要表達(dá)于原始生殖細(xì)胞，而不表達(dá)于支持細(xì)胞；在15和21d大鼠睪丸，NDRG2在生精小管內(nèi)主要表

5、達(dá)于精母細(xì)胞，而精原細(xì)胞和支持細(xì)胞未見陽性著色；在35d大鼠睪丸，NDRG2在生精小管內(nèi)主要表達(dá)于精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞；在成年（75d）大鼠，生精小管內(nèi)幾乎未見NDRG2陽性著色。分離純化21，35和75d大鼠睪丸生精細(xì)胞，采用RT-PCR和Westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證了NDRG2在青春期大鼠生精細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，而在成年大鼠生精細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)。分離純化21，35和75d大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示NDRG2在這三個時間點(diǎn)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均

6、有較強(qiáng)的表達(dá)，但相互間無明顯差異。
　　2．MAA腹腔注射3和6h與對照組相比未見顯著性差異，但MAA誘導(dǎo)12h后，成年大鼠睪丸內(nèi)出現(xiàn)大量初級精母細(xì)胞的凋亡，主要集中在生精周期的第X-XⅢ期，通過分離生精細(xì)胞和激光顯微切割技術(shù)均檢測到NDRG2在MAA誘導(dǎo)12h后在生精細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，免疫組織化學(xué)和間接免疫熒光結(jié)果均顯示NDRG2在自發(fā)性和MAA誘導(dǎo)凋亡的生精細(xì)胞中均高表達(dá)。
　　3．建立21d大鼠單側(cè)隱睪模型，術(shù)后7d和1

7、4d，隱睪側(cè)睪丸重量明顯減輕，凋亡生精細(xì)胞數(shù)明顯升高，免疫組織化學(xué)與間接免疫熒光結(jié)果顯示NDRG2在自發(fā)性和熱刺激誘導(dǎo)凋亡的生精細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均明顯上調(diào)，但在一些正常的精母細(xì)胞和圓形精子內(nèi)仍存在一定量的表達(dá)，并且NDRG2在隱睪側(cè)間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低。分離純化術(shù)后不同時間點(diǎn)隱睪側(cè)和對照側(cè)睪丸生精細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NDRG2和p53在術(shù)后7d隱睪側(cè)生精細(xì)胞的表達(dá)量明顯上調(diào)，而在隱睪后14d未見明顯差異，可能與生精細(xì)胞的凋亡與脫落有關(guān)；分離純化術(shù)

8、后不同時間點(diǎn)隱睪側(cè)和對照側(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了NDRG2在術(shù)后7和14d隱睪側(cè)間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量減少。
　　結(jié)論：
　　1.NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育不同階段持續(xù)表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，可能參與睪丸早期發(fā)育和睪酮的分泌與調(diào)節(jié)。
　　2.NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育過程中在生精細(xì)胞的表達(dá)存在較大差異，在青春期前在生精細(xì)胞有較高水平的表達(dá)，但在成年期表達(dá)量很低，提示NDRG2可能參與睪丸發(fā)育早期生精細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。