NDRG2在人甲狀腺髓樣癌中的表達及其功能的初步研究.pdf

1、甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中約5％左右為來源于濾泡旁細胞的甲狀腺髓樣癌。近年來，甲狀腺髓樣癌發(fā)病率在我國呈明顯上升趨勢，徹底闡明其發(fā)病機制并尋求有效的治療措施，是當今醫(yī)學界亟待攻克的一項重要課題。手術切除仍是目前臨床甲狀腺髓樣癌的首選治療方式，包括全甲狀腺切除和中央?yún)^(qū)淋巴結清除，但復發(fā)率及患者的遠期生存率并未得到較大的提高。內(nèi)放射治療即放射性核素治療，其中131I內(nèi)放療是最有效的輔助治療方法，主要用于原發(fā)灶切除不徹底、局部

2、復發(fā)或有轉(zhuǎn)移和不能手術切除的癌腫，可延長生存期。但對于失分化甲狀腺癌及甲狀腺髓樣癌，因其細胞攝碘水平極低而療效欠佳。如何提高131I內(nèi)放射治療的效果是是臨床亟待解決的問題。
　　鈉碘轉(zhuǎn)運體（Sodiumiodidesymporter，NIS）是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于正常甲狀腺濾泡膜上的一種糖化膜蛋白，其特異性介導碘離子進入甲狀腺細胞，是甲狀腺激素合成的第一限速步驟；有研究表明，NIS介導的碘離子主動轉(zhuǎn)運過程與Na+/K+-ATPase

3、有著密切的聯(lián)系；借助Na+/K+-ATPase主動轉(zhuǎn)運形成的Na+濃度階差，Na+順電化學梯度內(nèi)流時，I-與Na+以1∶2偶聯(lián)方式經(jīng)NIS介導進入甲狀腺細胞。有文獻報道外源性hNIS基因?qū)肴思谞钕偎铇影┘毎娠@著增加細胞131I的積聚率；NIS基因的克隆成功，為甲狀腺髓樣癌內(nèi)放射治療開辟了全新研究領域。
　　人源NDRG2基因是我校生物化學與分子生物學教研室最先發(fā)現(xiàn)并成功克隆的一個基因，功能學研究推測該基因為一新的抑癌候選基因，

4、參與細胞的增殖、分化和應激反應。前期的研究結果表明，NDRG2為甲狀腺腫瘤和正常甲狀腺組織的差異表達基因，可能參與甲狀腺髓樣癌的發(fā)生、發(fā)展；通過酵母雙雜交實驗尋找能與NDRG2相互作用的分子，結果篩選出3個有正確讀框的Na+/K+-ATPaseβ1的肽段；NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1在細胞內(nèi)存在共定位，并且可以穩(wěn)定Na+/K+ATPaseβ1蛋白、延長其半衰期；NDRG2能夠促進Na+/K+-ATPase的活性并增加其介導

5、的Na+轉(zhuǎn)運。
　　先前研究提示NDRG2在甲狀腺髓樣癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，特別是可能與鈉碘共轉(zhuǎn)運體的表達及功能高度相關，進而影響到放射性碘的攝取，本課題將對此進行探討和驗證。
　　目的
　　1、明確NDRG2及NIS在人甲狀腺腫瘤及正常組織中的表達模式；2、研究NDRG2在甲狀腺髓樣癌細胞中的功能及與NIS的關聯(lián)性；3、探討NDRG2對髓樣癌細胞放射性碘攝取的作用及腫瘤核素顯像研究。
　　方法
　　1

6、、運用組織芯片技術通過免疫組織化學方法明確NDRG2及NIS在人甲狀腺腫瘤及正常組織中的表達模式及定位；2、構建NDRG2過表達慢病毒并感染甲狀腺髓樣癌細胞TT，經(jīng)Blasticidin（殺稻瘟菌素）篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系TT-NDRG2（NDRG2過表達組）、TT-CHERRY（對照組、紅色熒光），采用RT-PCR和Western-blot檢測NDRG2過表達后對NISmRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平的影響；3、對獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染髓樣

7、癌細胞系進行MTT、平板克隆形成、細胞劃痕實驗、細胞侵襲實驗及流式細胞周期測定和凋亡分析，明確NDRG2對髓樣癌細胞增殖、侵襲、遷移和細胞周期的影響，碘離子攝取實驗檢測NIS高表達后對甲狀腺髓樣癌攝碘的影響；4、建立髓樣癌裸鼠成瘤模型，體外進一步觀察NDRG2過表達對髓樣癌的增殖和侵襲能力的影響，及移植瘤99mTcO4-核素顯像情況。
　　結果
　　1、免疫組織化學染色檢測結果顯示NDRG2和NIS均在正常甲狀腺組織中呈高表

8、達，在各病理類型甲狀腺腫瘤組織中呈低表達或不表達，二者的表達呈正相關趨勢，提示NDRG2和NIS有一定的相關性，在正常甲狀腺組織中，NDRG2定位于細胞胞漿、NIS定位于細胞質(zhì)膜；2、RT-PCR和Western-blot實驗證實重組慢病毒pLenti6.3/V5-DEST-NDRG2感染可以上調(diào)甲狀腺髓樣癌細胞NDRG2的表達，并且NDRG2過表達可顯著上調(diào)甲狀腺髓樣癌細胞NISmRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平；3、MTT、克隆形成實驗

9、結果顯示TT-NDRG2組細胞增殖能力和克隆形成數(shù)均顯著低于對照組（p<0.05），表明NDRG2過表達明顯抑制甲狀腺髓樣癌細胞的增殖；細胞劃痕實驗和細胞侵襲實驗結果顯示上調(diào)NDRG2可以顯著降低甲狀腺髓樣癌細胞的遷移和侵襲能力（p<0.05），流式細胞術檢測細胞周期結果顯示TT-NDRG2組與其它各對照相比細胞周期出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期細胞明顯增加（p<0.01），S期細胞明顯減少（p<0.01），提示NDRG2通過G1期細

10、胞周期阻滯而抑制髓樣癌細胞TT的增殖；通過流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示與對照TT-CHERRY組相比（細胞凋亡率0.5％），TT-NDRG2組凋亡細胞明顯增多（細胞凋亡率19.2％，p<0.05）；碘攝取實驗表明，TT-NDRG2組細胞攝碘迅速，約60分鐘達到攝取峰值，攝碘量較對照組高約17倍；4、裸鼠荷瘤實驗顯示TT-NDRG2組與對照組相比，腫瘤生長速度及瘤重均明顯小于對照組（p<0.01），通過體內(nèi)實驗進一步驗證NDRG2過表

11、達對甲狀腺髓樣癌增殖和侵襲的抑制作用，腫瘤99mTcO4-核素顯像結果表明TT-NDRG2組腫瘤部位可明顯聚集99mTcO4-，對照組腫瘤未顯像，說明甲狀腺髓樣癌細胞系TT-NDRG2過表達后獲得99mTcO4-顯像能力。
　　結論
　　本課題揭示NDRG2在甲狀腺髓樣癌細胞的增殖和侵襲中的作用，并探索其作用的分子機制，初步在甲狀腺髓樣癌中證實了NDRG2能上調(diào)NIS基因的表達，并能使細胞增加其介導的碘攝取能力，為甲狀腺髓樣