虎紋蛙病毒(TFV)MicroRNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、虹彩病毒(iridovirus)是一類感染無脊椎動(dòng)物和冷血脊椎動(dòng)物的大型DNA病毒，具有典型的正二十面體結(jié)構(gòu)，它們是魚類、蛙類和龜類等水生動(dòng)物的重要病原，對(duì)我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。虹彩病毒科被劃分為五個(gè)屬，分別是虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)和腫大細(xì)胞虹彩病毒屬(Megalocytivir

2、us)。本文的主要研究對(duì)象虎紋蛙病毒(TFV)是虹彩病毒科蛙病毒屬的成員，最早從廣東省南海市某虎紋蛙養(yǎng)殖場患病的虎紋蛙蝌蚪上分離、鑒定，同時(shí)也是第一個(gè)完成基因組全序列測定的蛙病毒屬的病毒。
　　 MicroRNA(miRNA)是一類長度約為22個(gè)核苷酸參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA(non-coding RNA)，在表達(dá)上具有組織和時(shí)間的特異性，這類小分子RNA可以通過誘導(dǎo)靶mRNA切割降解、翻譯抑制或者其他形式的調(diào)

3、節(jié)機(jī)制抑制基因的表達(dá)。MicroRNA普遍存在于植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的基因組中，并且在許多生物學(xué)過程包括細(xì)胞的分化和凋亡、激素分泌、信號(hào)傳導(dǎo)、個(gè)體的發(fā)育和疾病發(fā)生中起到非常重要的作用。最近的研究表明，病毒自身也可以編碼MicroRNA，病毒可以通過MicroRNA介導(dǎo)的干擾作用來調(diào)節(jié)自身和宿主基因表達(dá)，進(jìn)而影響宿主與病毒之間的相互作用關(guān)系。從發(fā)現(xiàn)首個(gè)病毒編碼的miRNA開始，現(xiàn)已在皰疹病毒、多瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒家族中發(fā)現(xiàn)了1

4、00余種病毒編碼的MicroRNA。隨著病毒miRNA的鑒定和功能的深入研究，將為尋找病毒感染的生物標(biāo)志物和治療方法提供了新的思路和方法。
　　 本研究以虹彩病毒科蛙病毒屬的虎紋蛙病毒為研究對(duì)象。首先將斑馬魚的胚胎細(xì)胞系ZF4進(jìn)行大規(guī)模傳代，通過測定病毒滴度，將TFV病毒稀釋至合適濃度后感染ZF4細(xì)胞，觀察細(xì)胞病理變化(CPE)的出現(xiàn)時(shí)間和嚴(yán)重程度，每隔4小時(shí)分23個(gè)時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞取樣，采用專門提取小分子RNA的試劑盒對(duì)TFV和

5、ZF4的microRNA分時(shí)間段提取，通過PAGE膠對(duì)提取的microRNA進(jìn)行數(shù)量和質(zhì)量上的初步分析和驗(yàn)證，將15-200 nt范圍內(nèi)的條帶進(jìn)行膠回收、純化以及濃縮；隨后將得到的miRNA使用SBI公司的試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在瓊脂糖電泳分離后將分子大小在50-350 bp范圍的條帶完成膠回收后連入pMD19-T vector進(jìn)行克隆，把得到的3314個(gè)有效的克隆的測序結(jié)果進(jìn)行三方面的分析，一是使用NCBI上的BLAST把序列結(jié)果與

6、ZF4和TFV的基因組比對(duì)，二是將序列在miRbase中進(jìn)行檢索以尋找miRNA序列的同源性與保守性，三是使用RNA structure、Vmir軟件對(duì)于莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，最后綜合三方面的分析結(jié)果，確定了10個(gè)候選TFV miRNA，設(shè)計(jì)DNA寡核苷酸的探針，運(yùn)用Northern Blot的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 通過建立TFV的MicroRNA文庫，為之后鑒定TFV的miRNA、探究TFV編碼的miRNA的功能及作用原理打下了