不同毒力PRRSVs感染后肺組織的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的，以妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的高度接觸性全球性的豬重要傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006-2007年，中國(guó)和越南大規(guī)模地暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)，病豬表現(xiàn)持續(xù)41℃高熱，引起各年齡階段的豬(包括

2、成年豬)異常高的發(fā)病率和死亡率。但目前對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征毒(H-PRRSV)和經(jīng)典性豬繁殖與呼吸綜合征毒(N-PRRSV)感染的分子致病機(jī)制及宿主的免疫反應(yīng)還不清楚。本論文通過比較H-PRRSV和N-PRRSV感染機(jī)體后，肺組織在轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組方面的差異，以期了解宿主免疫反應(yīng)的差異及H-PRRSV感染與機(jī)體嚴(yán)重的病理反應(yīng)之間的關(guān)系。
　　 首先建立了能夠快速鑒別診斷H-PRRSV與N-PRRSV的雙色TaqMan探針

3、和SYBRGreen-Ⅰ熒光定量PCR方法。根據(jù)經(jīng)典株和高致病株在NSP2基因序列的差異，在NSP2區(qū)設(shè)計(jì)了用于同時(shí)檢測(cè)高致病性毒株與經(jīng)典毒株和株系鑒定的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和株系特異性的探針。該方法，尤其是雙色TaqMan探針法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，可檢測(cè)到100拷貝/μl，可用于高效、大規(guī)模的檢測(cè)與鑒別PRRSV感染，為PRRS的預(yù)防和控制提供了有力的分子診斷工具。
　　 建立了可靠的H-PRRSV(G

4、D)與N-PRRSV(CH-1a)的仔豬感染模型，并進(jìn)行了熒光定量PCR、組織病理學(xué)、病毒的重新分離與間接免疫熒光、透射電鏡觀察等系統(tǒng)的鑒定。結(jié)果表明，GD株的致病性明顯強(qiáng)于CH-1a。主要表現(xiàn)在：GD株可引起仔豬41℃持續(xù)高熱，發(fā)病癥狀明顯比CH-1a感染豬嚴(yán)重，而且表現(xiàn)出更嚴(yán)重的增生性間質(zhì)性肺炎；GD株在感染豬體內(nèi)的病毒載量更高，而且組織嗜性比CH-1a明顯廣泛；GD毒株感染的樣品在Marc-145細(xì)胞上比CH-1a感染的樣品更容易

5、而且更快地得到分離。
　　 應(yīng)用基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)字化基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression Profile，DGEP)分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，詳細(xì)分析了H-PRRSV與N-PRRSV感染后，肺組織的轉(zhuǎn)錄組差異。結(jié)果表明，H-PRRSV與N-PRRSV感染都激活了宿主的先天性和獲得性免疫反應(yīng)，引起抗病毒的炎癥反應(yīng)，但過度的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致了免疫病理及隨后的組織損傷；可能是由于大量的H-PRRSV

6、感染有力地激活了與病理相關(guān)的通路，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡與氧化損傷等，顯著性地上調(diào)了CD14、CD163、IL-10、TNF-α、IRG6、MX2、KLRK1、C1QA、BAK、GZMA、CASP10、GADD45B、GP91-PHOX和HMOX1的轉(zhuǎn)錄豐度，并顯著性地下調(diào)表達(dá)抗氧化劑GPX2，導(dǎo)致了比N-PRRSV感染更嚴(yán)重的病理反應(yīng)，表現(xiàn)出高致病性。本研究結(jié)果為更好的理解豬繁殖與呼吸綜合征的分子致病機(jī)理及H-PRRSV感染與機(jī)體嚴(yán)重的

7、病理反應(yīng)之間的關(guān)系，并篩選和PRRS抗性或易感性相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 應(yīng)用熒光差異雙向凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gelelectrophoresis，2D-DIGE)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定與生物信息分析，初步分析了H-PRRSV與N-PRRSV感染后，肺組織的蛋白質(zhì)組變化。從48個(gè)差異蛋白點(diǎn)中鑒定出了45種蛋白，功能分析表明這些蛋白主要是與細(xì)胞骨架、應(yīng)激反應(yīng)及氧化