不同耐藥表型鮑曼不動(dòng)桿菌毒力及蛋白質(zhì)組學(xué)差異性研究.pdf

1、目的：
　　以內(nèi)蒙古地區(qū)住院病人分離鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對象，分析鮑曼不動(dòng)桿菌不同耐藥表型分離株體外粘附和侵襲能力是否存在差異，進(jìn)一步對3株不同耐藥表型分離株蛋白質(zhì)組學(xué)差異性進(jìn)行研究，探究鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性增加與其毒力變化之間是否存在相關(guān)性及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步闡明鮑曼不動(dòng)桿菌致病機(jī)制及指導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌感染防控和治療提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.菌株收集：隨機(jī)收集內(nèi)蒙古地區(qū)住院病人2011年11月—2013年1

2、1月間各類臨床標(biāo)本中分離50株鮑曼不動(dòng)桿菌作為研究對象。
　　2.體外藥敏試驗(yàn)：除多粘菌素外，其它抗菌藥物均采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行檢測，多粘菌素采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行檢測。
　　3.分子分型：分別采用脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法和多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技術(shù)對50株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行基因分型，分析其基因

3、型特征。
　　4.體外粘附實(shí)驗(yàn)：篩選不同基因型及耐藥性菌株為研究對象。纖維粘連蛋白（fibronectin,Fn,10μg/ml）包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，各孔中滴加不同鮑曼不動(dòng)桿菌菌懸液進(jìn)行孵育，采用分光光度計(jì)檢測每一實(shí)驗(yàn)孔的吸光值（OD值），以O(shè)D值大小表示粘附細(xì)菌的數(shù)量及密度，用以反映不同株的粘附能力。
　　5.體外侵襲實(shí)驗(yàn)：篩選不同基因型及耐藥性菌株為研究對象，采用抗生素保護(hù)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。A549肺腺癌細(xì)胞株與鮑曼

4、不動(dòng)桿菌菌懸液按照1:100比例進(jìn)行孵育，用多粘菌素清除未侵入細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及游離細(xì)菌。處理后細(xì)胞經(jīng)Triton-100裂解后等量接種麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，人工計(jì)數(shù)各平板細(xì)菌菌落數(shù)，以細(xì)菌菌落數(shù)的多少來反映每株鮑曼不動(dòng)桿菌侵襲能力的強(qiáng)弱。
　　6.蛋白質(zhì)組學(xué)分析：選取耐藥特征不同的3株菌作為研究對象，采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對三株菌菌體蛋白所得蛋白質(zhì)多肽質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，分

5、析不同耐藥株蛋白質(zhì)組學(xué)特征。
　　結(jié)果：
　　1.體外藥敏試驗(yàn)：僅A9株對哌拉西林耐藥而對其它所有測試藥物敏感，其余菌株耐藥表型差異明顯，都為多重耐藥株和泛耐藥株。
　　2.分子分型：50株鮑曼不動(dòng)桿菌共劃分為22個(gè)PFGE基因型，共29個(gè)亞型；其中，A和E型為優(yōu)勢型，分別占22％（11/50）和24%（12/50）；MLST分型結(jié)果顯示，50株菌共分4個(gè)基因型，優(yōu)勢型為ST208型，占56.00%(28/50)，其次

6、為ST368（10%，5/50）、ST373(8%,4/50）、ST191(4%,2/50)。其它11株菌部分基因測序結(jié)果不能與已公布序列匹配，可能是新的基因型。
　　3.體外粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果：體外粘附能力最強(qiáng)的菌株歸屬于PFGE型J型，該菌株對除頭孢他啶，頭孢吡肟和哌拉西林外都敏感；粘附能力最弱的菌株為PFGE型D型，僅對亞胺培南和多粘菌素敏感。多重耐藥株、泛耐藥株分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606和A9株相比，OD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義（p>0.05）。4.體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：體外侵襲能力最強(qiáng)的菌株屬于PFGE型P型，該株菌僅對哌拉西林耐藥而對其它所有測試藥物敏感。侵襲能力最弱的菌株為PFGE型D型，僅對亞胺培南和多粘菌素敏感。多重耐藥株和泛耐藥株分別與ATCC19606株進(jìn)行比較，細(xì)菌菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=32.5，p>0.05；U=18，p>0.05）；多重耐藥株和泛耐藥株分別與A9株相比，細(xì)菌菌落數(shù)明顯減少（U=4，p<0.05；U=5.5，p<0.05）；多

8、重耐藥株和泛耐藥株比較，細(xì)菌菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=139.5，p>0.05）。
　　5.蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果：A9株、多重耐藥株（A8株）和泛耐藥株（A1株）相比，49個(gè)差異蛋白的表達(dá)量呈逐步降低趨勢。從功能上劃分，這49個(gè)差異蛋白分可為三類：第一類：代謝相關(guān)酶或蛋白（27個(gè)）；第二類：基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白（3個(gè)）；第三類：未鑒定及功能未知蛋白質(zhì)（共19個(gè)）。22個(gè)差異蛋白的表達(dá)量呈逐步升高趨勢。從功能上劃分，這22個(gè)差異蛋白分可為兩

9、類：第一類：代謝相關(guān)酶或蛋白（13個(gè)）；第二類：未鑒定及功能未知蛋白質(zhì)（共9個(gè)）。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)蒙古地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株基因型呈多樣化特征，不同基因型菌株耐藥譜差異明顯。
　　2.耐藥表型不同的鮑曼不動(dòng)桿菌，其體外粘附能力未見明顯差異。但耐藥性強(qiáng)的菌株，其體外侵襲力呈逐漸降低趨勢，耐藥性的增加可能與其侵襲力大小呈負(fù)相關(guān)。
　　3.耐藥性強(qiáng)的鮑曼不動(dòng)桿菌，多種差異蛋白表達(dá)量表現(xiàn)降低或升高，這一結(jié)果提