雙單倍體牙鲆純合不育個體的蛋白質(zhì)組和轉錄組學研究.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）個體大、生長速度快、肉質(zhì)細嫩鮮美，被視為名貴的海產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，深受我國廣大消費者的喜愛，市場銷售前景廣闊。牙鲆雌性生長速度快于雄性，養(yǎng)殖全雌牙鲆對提高其生長速度、縮短養(yǎng)殖周期和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要意義。利用有絲分裂雌核發(fā)育技術不僅能夠生產(chǎn)全雌魚，還能夠生產(chǎn)基因完全純合的個體，即雙單倍體(DH)，在此基礎上再進行一代雌核發(fā)育可以生產(chǎn)基因型完全一致的純合克隆系，這對雌核發(fā)育育種的理論研究

2、和實際應用均具有重要意義。但存在的問題是DH魚誘導困難，繁殖力低，極大的影響了DH和克隆魚的進一步應用。目前關于DH魚的繁殖問題開展的研究工作較少，僅有的少量研究主要集中在繁殖能力的表型描述上，具體的不育機制尚不清楚。因此，本研究通過減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高牙鲆純合度后，以此為親本誘導DH，探討提高DH誘導效率的可行性;同時以同齡性腺正常發(fā)育的牙鲆為對照，對DH牙鲆的促性腺激素和性類固醇激素含量進行了測定，以期從內(nèi)分泌學角度揭示DH牙鲆性腺

3、發(fā)育異常的原因;在此基礎上對同一家系可育和不育牙鲆的性腺進行了蛋白質(zhì)組學和轉錄組學的比較，篩選了可育和不育性腺的差異表達蛋白和基因，探討引起DH純合不育的分子機制，并為尋找其中起關鍵作用的蛋白和基因并研究其功能提供有用的信息。主要研究結果如下:
　　(1)利用普通牙鲆親魚6尾（記為C1、C2、C3、C4、C5、C6）和減數(shù)分裂雌核發(fā)育組牙鲆6尾（記為G1、G2、G3、G4、G5、G6）進行DH誘導實驗，探討親魚純合度與DH誘導率的

4、關系。結果表明，雌核發(fā)育組的純合度極顯著高于普通組（P＜0.01），雌核發(fā)育組平均純合度為0.70，而普通組親魚的平均純合度僅為0.43。有5尾普通親魚（G2-G6）誘導的后代在開口前全部死亡，對剩余7尾親魚的后代在生長至20日齡時各取30尾仔魚進行后代純合性檢驗，發(fā)現(xiàn)有2尾雌核發(fā)育親魚的后代中出現(xiàn)了雜合個體，而在普通親魚后代中并未出現(xiàn)，推測后代中是否出現(xiàn)雜合子與親本的純合度并無直接無關。從誘導率上來看，無論是折算孵化率還是折算正常率，

5、雌核發(fā)育組均要顯著高于普通牙鲆組。通過相關分析發(fā)現(xiàn)，親本純合度與折算孵化率的Pearson相關性密切，其相關系數(shù)為0.920，達到極顯著水平(P＜0.01);親本純合度與折算正常率的Pearson相關性密切，其相關系數(shù)為0.925，達到極顯著水平(P＜0.01)。另外，本實驗誘導了C1和G3的減數(shù)分裂雌核發(fā)育，其誘導率和正常率均高于有絲分裂雌核發(fā)育。
　　(2)以2009年在北戴河中心實驗站培育的DH牙鲆為材料，以同齡的兩性受精牙

6、鲆為對照，在1月、3月和5月進行尾部采血，采用酶聯(lián)免疫方法測定和比較了血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、促黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)和17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)的含量，同時在5月份取性腺進行切片觀察發(fā)育情況，以期從內(nèi)分泌學角度揭示DH牙鲆性腺發(fā)育異常的原因。結果表明，DH組牙鲆性腺體積小，性腺成熟系數(shù)低，僅為4.0％，卵母細胞多為不規(guī)則的多角形，以Ⅱ期和Ⅲ期為主，外部只有一層濾泡細胞。而對照組牙鲆性

7、腺體積大，性腺成熟系數(shù)極顯著高于DH牙鲆，達到了10.1％，細胞核膜消失并開始向動物極遷移，此時卵巢內(nèi)以成熟的Ⅳ期和Ⅴ期卵母細胞為主。激素水平上來看，在1月和3月份時，各激素含量與對照組牙鲆均未出現(xiàn)顯著性差異，而5月份各激素含量均出現(xiàn)了顯著性變化，其中DH不育牙鲆的E2含量顯著低于對照組，同時LH和FSH的含量也要顯著低于對照組，T和17α，20β-DHP含量DH組卻顯著高于對照組，推測不育個體的T轉化為E2和E2與17α，20β-DH

8、P途徑轉換過程中出現(xiàn)了異常。
　　(3)以選取同一DH家系中3條能夠正常產(chǎn)卵的DH牙鲆為對照，3條無法正常產(chǎn)卵的DH牙鲆為實驗組進行了差異蛋白質(zhì)學研究。通過雙向凝膠電泳結合質(zhì)譜技術對可育和不育的蛋白質(zhì)組結果進行比較，共發(fā)現(xiàn)了42個差異顯著的蛋白，其中不育組中高表達蛋白11個，可育組中高表達蛋白31個。31個可育組高表達蛋白當中有2個蛋白只在可育組中表達，不育組中未見表達。差異蛋白中Vtg在不育組中的含量要顯著低于可育組，這與組織切

9、片中觀察到的不育組卵母細胞發(fā)育過程中卵黃積累不足相一致，暗示不育組性腺發(fā)育停止與Vtg的含量較低有關。性類固醇調(diào)控相關的2個蛋白，核基質(zhì)結合因子2(SAFB2)和膽固醇側鏈內(nèi)切酶(P450SCC)也在不育組中低量表達，尤其是SAFB2在不育組中未見表達，會對不育DH牙鲆的性類固醇生成途徑產(chǎn)生影響。此外，3個和鈣離子平衡相關的蛋白在不育組中的表達同樣低于可育組，分別為NUCB1、EFCAB3和EFCAB4B蛋白，推測這3個蛋白通過調(diào)控鈣離

10、子的平衡來影響牙鲆的性腺發(fā)育。
　　(4)采用RNA-Seq技術研究了同一家系可育DH牙鲆和不育DH牙鲆性腺組織的轉錄組，并對差異表達基因進行了統(tǒng)計分析。應用CAP3軟件聚集全部轉錄樣本的裝配結果，獲得的轉錄組測序結果包括了52474個contigs和N50長度是2895bp;應用BWA軟件將cleanreads定位到All-Unigene，定位率可以達到99％，說明裝配質(zhì)量良好;獲得的unigenes中有31831條能夠比對到斑

11、馬魚上，通過GO注釋可以發(fā)現(xiàn)，有29416條unigenes注釋到了生物學進程，29475條unigenes注釋到了分子功能，29464條unigenes注釋到了細胞組分。對可育組和不育組表達差異的unigene進行篩選，得到差異表達unigenes1225個，包括492個上調(diào)unigenes和733個下調(diào)unigenes。1225條unigenes當中有573個基因被注釋，其中351個參與了生物學進程，63個處于細胞位置和128個具有

12、分子功能(P＜0.01)。顯著上調(diào)基因主要參與了甾醇代謝進程、類固醇生物合成進程和C21類固醇生物學合成等進程，在這些進程中主要是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1，CYP21A1，HSD3β和PRLR這6個基因高量表達。顯著的下調(diào)基因主要參與了免疫反應、維生素D代謝進程、抗原加工、血紅蛋白輸入、腎吸收、轉胞吞作用、脂肪蛋白轉運和蛋白質(zhì)水解作用等進程。通過KEGG數(shù)據(jù)對差異顯著基因進行Pathway分析，利用fish exa

13、ct rest檢驗發(fā)現(xiàn)62個pathways具有顯著性，包括26個顯著上調(diào)的pathways和36個顯著下調(diào)的pathways。最顯著的pathway是類固醇生物合成途徑，主要被4個基因影響，分別是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1和CYP21A1。另外一個重要的途徑是卵巢類固醇生成途徑，其它重要的途徑包括金黃色釀膿葡萄球菌感染、自身免疫甲狀腺疾病、造血細胞系、蛋白消化和吸收等主要受下調(diào)基因影響。
　　綜合上述，本研究

14、得到以下結論:親魚的純合度越高，DH的孵化率越高，孵化出的個體畸形率越低，利用減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高后代的純合度，再進行誘導DH，可以提高DH牙鲆的誘導效率。通過對可育牙鲆和不育牙鲆的蛋白質(zhì)組、轉錄組學分析可以看出，一些調(diào)控性固醇激素合成進程中的重要基因和蛋白，如CYP11A1、CYP11B2、CYP17A1、CYP21A1、SAFB2等均在不育牙鲆中低量表達，而且通過激素水平測定也發(fā)現(xiàn)，LH、FSH和E2在繁殖季節(jié)均要顯著低于可育組，這