靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在蟲草真菌中的表達與特性分析.pdf

1、冬蟲夏草（Cordyceps.）在分類上屬于子囊菌綱肉座菌目麥角菌科蟲草屬真菌，是我國古已有之的藥用真菌。蟲草生長于高山雪原，冬天為蟲夏天為草，數(shù)量稀少且難于采摘，歷來在我國與人參、鹿茸并稱為三大補品，其藥用價值非常廣泛，在保肺益腎、抗癌方面尤為突出。近年來，隨著蟲草各方面藥效的不斷開發(fā)和利用，蟲草的研究也備受人們的關(guān)注，但對于其實驗室培養(yǎng)以及在分子生物學(xué)方面的研究卻相當(dāng)鮮見。所以對蟲草進行分離鑒定、純化培養(yǎng)、分子學(xué)修飾，研究并提高其免

2、疫調(diào)節(jié)功能的藥用價值有非常重要的現(xiàn)實意義和經(jīng)濟價值。
　　 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungal immunomodulatory protein,Fip）是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一個蛋白質(zhì)家族，其結(jié)構(gòu)和功能與免疫球蛋白及植物凝集素相似。1989年，Kino等從靈芝（Ganoderma lucidum）中分離純化到第一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8。隨后，其他免疫調(diào)節(jié)蛋白也被分離得到。該類蛋白可以促進人類末梢淋巴球（human peripher

3、al lymphocytes）細胞以及白鼠脾淋巴細胞的增生等，增強人體免疫機能。將靈芝真菌的免疫調(diào)節(jié)蛋白基因轉(zhuǎn)入冬蟲夏草菌中發(fā)揮其強大的醫(yī)療保健效果，不僅為蟲草的分子生物學(xué)研究開辟了道路，而且可以帶來非常可觀的經(jīng)濟效益。
　　 本研究從采自新疆的冬蟲夏草蟲體中分離得到冬蟲夏草菌絲，對其進行分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等多方面研究，鑒定其品種并確定純化到的菌絲為冬蟲夏草（Cordyceps scarabaeicola）。且進一步對蟲草的培養(yǎng)

4、條件進行優(yōu)化，獲得較純的生長旺盛的菌絲體。
　　 用RT-PCR的方法成功從靈芝（Ganoderma lucidum）菌絲體中擴增得到真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fip）基因，對其進行修飾，加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號（ER retention signal）KDEL序列，以提高外源蛋白的表達量。在實驗室真菌轉(zhuǎn)化相關(guān)經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，選用克隆自香菇的真菌強啟動子GPD（三磷酸甘油醛脫氫酶）驅(qū)動免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fip）基因，以具有除草劑（PPT）抗性的bar

5、基因作為篩選標記基因，構(gòu)建真菌表達載體p3300bfipk。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的表達載體導(dǎo)入至冬蟲夏草（Cordyceps scarabaeicola）基因組中，通過篩選獲得抗性菌株。對抗性菌株進行PCR檢測，得到轉(zhuǎn)基因蟲草。挑選生長情況良好的轉(zhuǎn)基因蟲草菌株，提取RNA進行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分陽性菌株中的目的基因均在轉(zhuǎn)錄水平可以檢測到。
　　 本研究不僅對蟲草進行了分子生物學(xué)方面的研究，且為蟲草免疫調(diào)節(jié)方