紫花苜蓿褐斑病抗性基因分子標(biāo)記研究.pdf

1、本研究對前人篩選的分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性和通用性進(jìn)行了鑒定并建立一套快速準(zhǔn)確對苜蓿褐斑病抗性鑒定和遺傳資源篩選的技術(shù)體系,提高抗病檢測效率,為抗病基因的克隆和遺傳圖譜的建立提供了可靠性高的標(biāo)記位點(diǎn),為苜?？购职卟?biāo)記輔助選擇育種以及抗褐斑病基因的定位、克隆奠定基礎(chǔ),對苜?？购职卟》N質(zhì)資源的高效篩選利用和苜蓿抗病育種研究有重要意義。本項研究得到的主要結(jié)果如下:
　　 選取4個具有不同遺傳背景的紫花苜蓿品種為研究材料,先通過人工接種試驗,

2、根據(jù)病情指數(shù)和抗病性分級標(biāo)準(zhǔn)得出,4個品種的抗病性依次為:賽迪>新疆大葉>中苜一號>龍牧801,賽迪屬于高抗品種,新疆大葉、中苜一號和龍牧801屬于中抗品種,龍牧801的抗病性最低。在4個品種中各篩選出高抗單株10株,病情指數(shù)的平均值在2.11-2.29之間,高感單株10株,病情指數(shù)的平均值在63.75-75.77之間。4個品種的總體病情指數(shù)和抗病性成反比,篩選到的高抗、高感單株的抗病性與4個品種的總體抗病性基本相符。
　　 運(yùn)

3、用ISSR、AFLP和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對標(biāo)記適用性進(jìn)行驗證。結(jié)果表明:適用性高的標(biāo)記有感病標(biāo)記ISSR22S450、抗病標(biāo)記SRAPM3E3R169和ISSR20R750,分子標(biāo)記檢測的符合率在75～85％之間,可用于苜蓿褐斑病的標(biāo)記輔助選擇育種工作。適用性中等的標(biāo)記有感病標(biāo)記ISSR6S640和AFLP38S264,抗病標(biāo)記AFLP1R206、AFLP16R185和ISSR834R450均在1個品種中顯示出差異不顯著,仍需在更多品

4、種中驗證；適用性差的標(biāo)記有感病標(biāo)記ISSR11S750和ISSR22S640,不能作為檢測苜蓿褐斑病的可靠指標(biāo)。本研究結(jié)果不僅為將上述標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ),而且為抗病基因的克隆和遺傳圖譜的建立提供了可靠性高的標(biāo)記位點(diǎn)。
　　 建立抗、感DNA池,通過優(yōu)化紫花苜蓿(Medicago sativa.L)SCAR-PCR主要參數(shù),建立紫花苜蓿SCAR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序。20μL的反應(yīng)體系中各反應(yīng)物的含量為:10×PCRBu

5、ffer(Mg+Plus15mM)2μL,dNTP(TaKaRa,2.5μM)0.2μM,正／反Primer(Sangon,1μM)0.25μM,模板DNA(10n／μL)20ng,Taq酶(TaKaRa,5U／μL)0.8U,ddH2O9.24μL。采用梯度PCR確定退火溫度,共設(shè)計7個退火溫度:48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃。擴(kuò)增程序為:94℃,5min；94℃,30sec;退火溫度30sec:72℃,1mi

6、n；36個循環(huán);72℃,10min。
　　 在通用性高和中等的與苜蓿褐斑病連鎖的標(biāo)記的基礎(chǔ)上,設(shè)計了53對SCAR引物,其中ALSR834S-4、ALSR20-1、ALSS22A-1、ALSS22A-2、AFLP-M1P1-7、AFLP-M2P8-8、AFLP-M5P6-2共7個SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化成功,占13.21％。
　　 設(shè)計的3個SCAR-SRAP標(biāo)記在抗、感單株間均擴(kuò)出條帶,多態(tài)性消失。將3個標(biāo)記的抗、感單株的PC