新型釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及雞球蟲EtMic2活載體疫苗的免疫保護性研究.pdf

1、隨著DNA技術(shù)的發(fā)展，微生物的表面展示技術(shù)也有長足進步。所謂的表面展示技術(shù)是指利用微生物自身的表達系統(tǒng)，將表達的外源肽或蛋白質(zhì)通過錨定蛋白錨定在微生物細胞的表面。微生物表面展示系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于開發(fā)全細胞催化劑、研究蛋白質(zhì)間的相互作用、篩選抗體和研發(fā)口服活載體疫苗等方面。除了噬菌體展示，細菌表面展示和酵母表面展示也相繼報道。
　　現(xiàn)有的酵母表面展示系統(tǒng)，根據(jù)錨定蛋白不同，分為凝集素展示系統(tǒng)和絮凝素展示系統(tǒng)。最常用的且已商品化的釀酒酵母

2、展示系統(tǒng)是EBY100/pYD1(Invitrogen)，此系統(tǒng)不適用于酵母野株，表達菌需要進行基因工程改造替換AGA1啟動子為GAL1-10，在表達菌的選擇方面受到了極大的限制，急需構(gòu)建適應(yīng)性強、操作簡單的新型表面展示系統(tǒng)。
　　隨著禁用藥物法規(guī)的出臺和耐藥蟲株的出現(xiàn)，免疫預(yù)防成為控制球蟲病的主要措施。鑒于球蟲生活史復(fù)雜，蛋白表達具有階段性等特點，目前有效疫苗較少。微線蛋白-2(EtMic2)作為一種與球蟲入侵相關(guān)的粘附蛋白，能

3、誘導(dǎo)雞體對球蟲產(chǎn)生一定的免疫保護作用。
　　釀酒酵母是公認的益生菌，不但對機體安全無毒，而且能夠有效刺激機體的非特異免疫，提高免疫力。以酵母作為表達載體，制備的疫苗在抗菌、抗病毒方面顯示了很好的療效。同時，酵母菌有類似高等生物的翻譯后修飾機制，在表達真核生物蛋白（如:柔嫩艾美爾球蟲）方面比細菌等更具優(yōu)勢。盡管，有研究表明，酵母的發(fā)酵產(chǎn)物具有一定抗球蟲感染的作用，然而，利用酵母制備抗球蟲的口服活載體疫苗還未見報道。
　　刺激機

4、體提高免疫力的有效成分是酵母細胞壁，利用雙向電泳比較疫苗株與原酵母株的差異蛋白組，以期評價EtMic2的展示對酵母細胞壁蛋白組的影響。
　　1、新型釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
　　本研究，以一個帶有雙向啟動子的質(zhì)粒pSP-G2為基礎(chǔ)質(zhì)粒，分別將AGA1和AGA2表達盒克隆至pSP-G2雙向啟動子PGK1和TEF1下游，表達G418的抗性基因KanM作為篩選標記，構(gòu)建酵母展示質(zhì)粒pYSD。將EGFP和EtMIC2克隆至AGA2

5、表達盒下游，并分別轉(zhuǎn)染酵母野株（CICC1224和HAO）和基因工程菌(EBY100和W303-1A)，EGFP和EtMic2的展示，表明新型釀酒酵母展示系統(tǒng)構(gòu)建成功。為檢測釀酒酵母自身Aga2p的表達對外源蛋白的展示有無影響，構(gòu)建EBY100△aga2，分別轉(zhuǎn)染pYSD-EtMIC2，結(jié)果表明，EBY100基因組Aga2p對外源蛋白的展示無影響。為檢測外源蛋白的展示是否對酵母細胞本身的生長產(chǎn)生影響，對轉(zhuǎn)化有不同質(zhì)粒的酵母細胞（HAO/

6、pYSD、HAO/pYSD-EtMIC2和HAO/pYSD-GFP）和空白酵母(HAO)進行了生長曲線和倍增時間的測定。結(jié)果表明不同菌株的生長曲線相似，倍增時間無差異，因此，外源蛋白（EGFP和EtMic2）的展示沒有改變酵母細胞的生長特性，對其生長無影響。pYSD展示質(zhì)粒含有表面展示所需的所有元件，因此，新型釀酒酵母展示系統(tǒng)操作簡便，不受表達菌的限制，可同時適用于酵母野株和工程菌。
　　2、EtMic2口服酵母疫苗的制備及其免疫

7、保護效果的評價
　　為進一步確定EtMic2的展示，選擇100mM的二硫蘇糖醇(DTT)還原Aga1p和Aga2p-EtMic2之間的二硫鍵，用EtMic2單抗進行Western Blot鑒定。確定表達后，將展示有EtMic2的全酵母細胞(HAO/pYSD-EtMIC2)口服免疫雛雞，分別設(shè)白對照，紅對照，空質(zhì)粒對照(HAO/pYSD)，免疫三周后，攻柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊3000個/只，白對照除外。對各組免疫雞采血，分離血清，

8、用間接ELISA方法測定血清中抗體水平和細胞因子，用MTT法檢測細胞免疫水平。結(jié)果表明，HAO/pYSD-EtMIC2能誘導(dǎo)有效的細胞免疫和體液免疫反應(yīng);攻蟲后，HAO/pYSD-EtMIC2組能提高相對增重為80.9％，卵囊減少率達76.56％，盲腸病變計分為2.3±0.46，表明能對Etenella產(chǎn)生一定的免疫保護作用。
　　3、EtMic2的展示對酵母細胞壁蛋白的影響
　　刺激機體提高免疫力的有效成分是酵母細胞壁，應(yīng)

9、用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)比較分析疫苗株(HAO/pYSD-EtMIC2)和空白酵母(HAO)的細胞壁蛋白，在相同處理條件下，通過蛋白質(zhì)雙向電泳分離兩株酵母菌得到約210個蛋白點，選取兩者差異表達2倍以上的點20個，其中，14個點在HAO/pYSD-EtMIC2中表達上調(diào)，6個點在HAO/pYSD-EtMIC2中表達下調(diào)，進行質(zhì)譜分析，4個蛋白點測序未成功。16個測序成功的蛋白中，按蛋白功能分為4類，分別與細胞骨架相關(guān)蛋白、催化酶、功能代謝蛋