新型畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)研究.pdf

1、隨著基因工程的發(fā)展，微生物表面展示系統(tǒng)已發(fā)展出噬菌體展示系統(tǒng)、細(xì)菌表面展示系統(tǒng)、酵母表面展示系統(tǒng)等，廣泛應(yīng)用在生物學(xué)研究及工業(yè)生產(chǎn)的許多領(lǐng)域，例如研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互識(shí)別與相互作用、由多肽構(gòu)象或蛋白質(zhì)突變庫中獲取特定功能蛋白、生產(chǎn)抗體、生產(chǎn)口服疫苗、開發(fā)全細(xì)胞催化劑、開發(fā)生物傳感器、開發(fā)細(xì)胞吸附劑等等，成為競(jìng)相研究的熱點(diǎn)。 但己發(fā)展的微生物表面展示系統(tǒng)都存在自身明顯的缺陷：噬菌體展示系統(tǒng)展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否

2、則會(huì)影響噬菌體的裝配與感染；革蘭氏陰性菌表面展示系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白易以包涵體形式存在，展示的蛋白不僅要通過質(zhì)膜層，還要在外膜上正確的整合，這可能對(duì)展示蛋白的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響；革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚，轉(zhuǎn)化效率較低，這樣會(huì)影響大容量肽庫的構(gòu)建；兩種細(xì)菌表面展示系統(tǒng)均缺乏翻譯后修飾功能，容易使展示的真核蛋白失活；釀酒酵母中雖存在蛋白質(zhì)翻譯后修飾，但糖基化方式與哺乳動(dòng)物不同，它對(duì)外源蛋白N-糖基化修飾形式是高甘露糖型，糖鏈平均為50-150甘露

3、糖殘基，并且核心寡糖末端是α-1，3-甘露糖，從而使生產(chǎn)的蛋白在人體中有比較強(qiáng)的免疫原性，過度糖基化還可能使表達(dá)的酶等功能性蛋白失活。 畢赤酵母(Pichia Pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。其具有易于培養(yǎng)、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子，可調(diào)控外源基因的表達(dá)、可對(duì)外源蛋白進(jìn)行更接近高等生物的加工折疊和翻譯后修飾、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等的特性，成為微生物表面展示系統(tǒng)極有應(yīng)

4、用前景的宿主菌。 目前已有的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)主要是利用來自釀酒酵母Flol蛋白的N端絮凝結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定蛋白將外源蛋白展示于菌體表面，融合蛋白非共價(jià)連接于畢赤酵母細(xì)胞壁上。展示的外源蛋白通過N端與錨定蛋白融合，C端蛋白游離，這樣的系統(tǒng)適合脂酶等活性位點(diǎn)在C端的功能蛋白。但對(duì)活性位點(diǎn)在N端的功能蛋白表達(dá)不利，限制了更廣泛的應(yīng)用。為豐富畢赤酵母展示系統(tǒng)，展示不同需要的外源蛋白，本文做了以下3部分工作：第一部分：Pirl型畢赤酵母表面

5、展示系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)研究Pit(Proteins with internal repeats)系列蛋白是釀酒酵母中共價(jià)連接細(xì)胞壁的甘露糖蛋白，C端無保守的GPI錨定序列，直接與細(xì)胞壁中β-1，3-葡聚糖相連。成熟肽蛋白N端有數(shù)目不等的重復(fù)序列，可被溫和堿(30 mM NaOH，12 h，4 ℃)從細(xì)胞壁抽提。外源蛋白可通過與Pir蛋白N端融合、C端融合或插入融合展示在菌體表面。目前Pir系列蛋白在釀酒酵母表面已成功展示了多種外源蛋白。

6、 本研究克隆了來自釀酒酵母EBY100的Pirl蛋白成熟肽基因(Pirl-α)，連接入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了新型畢赤酵母表面展示的通用載體pPIC9K-Pirl-a。利用α-factor信號(hào)肽將蛋白引導(dǎo)分泌至細(xì)胞外。通過免疫熒光分析以C端與Pirl-a蛋白融合而展示于畢赤酵母表面的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)，證明新的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)

7、的構(gòu)建是成功的。但激光熒光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察到EGFP-Pirl-a融合蛋白的展示是不規(guī)則的，分析這種不規(guī)則的展示可能與Pirl蛋白自身性質(zhì)相關(guān)。進(jìn)一步以Pirl成熟肽N端重復(fù)序列(Pirl-b蛋白)為錨定蛋白，構(gòu)建新的畢赤酵母表面展示載體pPIC9K-Pirl-b，表面展示的模式蛋白仍采用EGFP℃LSM觀察到新的融合蛋白EGFP-Pirl-b是規(guī)則的展示

8、在重組畢赤酵母表面。Western bloti證明了融合蛋白EGFP-Pirl-a與EGFP-Pirl-b可被溫和堿從重組畢赤酵母細(xì)胞壁抽提，并且很少分泌到培養(yǎng)基中。熒光分光光度計(jì)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分別以Pirl-a和Pirl-b為錨定蛋白時(shí)，相同誘導(dǎo)條件下，表面展示EGFP的重組畢赤酵母菌株的熒光強(qiáng)度是相當(dāng)?shù)?。以上結(jié)果說明釀酒酵母的Pirl蛋白可作為畢赤酵母的錨定蛋白，將外源蛋白展示于畢赤酵母表面，融合蛋白沒有改變Pirl蛋白自身

9、的錨定性質(zhì)：同時(shí)說明了Pirl成熟肽蛋白中，其N端重復(fù)序列對(duì)其錨定在細(xì)胞壁起主要作用，C端序列對(duì)其在表面的不規(guī)則展示起主要作用。 第二部分：α凝集素型畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及畢赤酵母表達(dá)重組蛋白純化新方法的探討α凝集素是是釀酒酵母中共價(jià)連接細(xì)胞壁的GPI(Glycosyl phosphatidylinositol)型甘露糖蛋白的一種，C端有GPI錨定序列，并通過β-1，6-葡聚糖連接至β-1，3-葡聚糖，可被β-1，3-或β

10、-1，6-葡聚糖酶作用。外源蛋白可通過C端與α凝集素C末端融合表達(dá)而錨定在細(xì)胞表面。目前以α凝集素C末端為錨定蛋白在釀酒酵母表面已成功展示了多種外源蛋白。本研究克隆了來自釀酒酵母EBY100的α凝集素的C末端基因，連接入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了新型畢赤酵母表面展示通用載體pPIC9K-AGal。利用α-factor信號(hào)肽將外源蛋白引導(dǎo)分泌至細(xì)胞外，同時(shí)在錨定蛋白序列前增加了MluI、ApaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)及Xpres

11、s抗原序列，提供了腸激酶作用位點(diǎn)。通過免疫熒光分析以C端與α凝集素的C末端蛋白融合而展示于畢赤酵母表面的EGFP，證明新的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建是成功的。通過熒光顯微鏡觀察及Western blot分析證明了腸激酶可將展示在重組畢赤酵母表面的EGFP與菌體分離，從而探討了純化畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的新方法：外源蛋白可利用畢赤酵母的體系進(jìn)行需要的折疊、翻譯后修飾并分泌到胞外，通過錨定蛋白展示于菌體表面，經(jīng)腸激酶作用，可從菌體表面分離下來

12、。 第三部分：兩種畢赤酵母表面展示系統(tǒng)展示外源蛋白能力的比較在成功地以來自釀酒酵母的Pir1蛋白及α凝集素C末端為錨定蛋白構(gòu)建了畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以通過C端分別與兩種錨定蛋白融合的EGFP為報(bào)告蛋白，通過研究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH、甲醇誘導(dǎo)濃度等搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵條件，探討不同發(fā)酵條件分別對(duì)兩種重組畢赤酵母菌株表面展示融合蛋白的影響。并在兩者各自最適的發(fā)酵條件下對(duì)其展示外源蛋白的能力進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α凝