基于酵母表面展示系統(tǒng)的HIV抗體分離和表達(dá).pdf

1、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）的防治問題是當(dāng)今全球臨床研究人員亟需解決的重要課題。由于HIV具有高度變異的特點(diǎn)，研究人員在尋找能夠?qū)IV病毒提供具有長效廣譜作用的中和抗體的過程中一直面臨著極大的困難。本文將通過設(shè)計(jì)有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分離并表達(dá)可與HIV特異性結(jié)合的抗體。為此，需要解決兩個(gè)重要問題，如何選擇靶抗原以及如何展示抗體文庫。
　　針對(duì)第一個(gè)問題，研究人員通過分析當(dāng)前已經(jīng)

2、找到的HIV廣譜中和抗體，發(fā)現(xiàn)這些抗體對(duì)應(yīng)的病毒抗原表位主要分布在HIV包膜糖蛋白gp120/gp41上的一些保守位點(diǎn)。因此，本課題組研究人員提出了找到合適靶抗原的新方法，即根據(jù)病毒表面的保守表位來設(shè)計(jì)并合成抗原肽?；谇捌诘难芯拷Y(jié)論，本文提出將靶抗原的設(shè)計(jì)定位于HIV廣譜中和抗體10E8所對(duì)應(yīng)的表位，即gp41近膜區(qū)域(membrane-proximal external region，MPER)上的一段保守位點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)此保守位點(diǎn)進(jìn)

3、行化學(xué)合成與修飾，得到與實(shí)際抗原功能相近的一段多肽，從而利用合成的肽段篩選抗體文庫。
　　解決第二個(gè)問題，需要從眾多的表面展示技術(shù)中，挑選一種用來展示抗體文庫。本文選擇酵母表面展示系統(tǒng)進(jìn)行抗體文庫的展示。一方面，由于酵母細(xì)胞作為真核細(xì)胞，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)加工等方面具有優(yōu)勢(shì)，更適合對(duì)人類抗體片段的表達(dá)及展示。另一方面，在實(shí)驗(yàn)過程中，酵母細(xì)胞也易于培養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)胞篩選。同時(shí)，本文選取易于基因操作和表達(dá)的單鏈抗體(Si

4、ngle Chain Fragment Variable,scFv)文庫展示在酵母細(xì)胞表面。在酵母細(xì)胞表面展示了包含有109個(gè)單鏈抗體的非免疫人類單鏈抗體文庫，其中存在產(chǎn)生廣譜中和抗體的基因。
　　本文提出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括如下三個(gè)步驟:首先，對(duì)酵母表面展示的單鏈抗體文庫進(jìn)行兩輪免疫磁珠分選(Megnetic Activated Cell Sorting，MACS)及兩輪流式細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Ce

5、ll Sorting，F(xiàn)ACS)過程;其次，從篩選出的抗體文庫中隨機(jī)挑選30株進(jìn)行基因測(cè)序，對(duì)得到的12株不同單克隆進(jìn)行鑒定，其中有4株為陽性結(jié)果克隆;最后，將這4株陽性克隆進(jìn)行單鏈抗體的分泌、純化，并進(jìn)一步構(gòu)建載體，將其以全長形式進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)再次驗(yàn)證，以全長形式表達(dá)的抗體仍能夠與抗原肽結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)從酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)展示的單鏈抗體文庫中，分離和表達(dá)出可與靶抗原特異性結(jié)合的抗體，并建立從酵母表面展示的單鏈抗體文庫