布魯氏菌PCR檢測方法的應(yīng)用與分子分型研究.pdf

1、為彌補(bǔ)微生物學(xué)和血清學(xué)方法在布魯氏菌檢測中的不足，以及探索、建立一種快速、準(zhǔn)確的布魯氏菌基因分型方法，本研究開展了以下三個(gè)方面的研究：
　　 首先，通過對已發(fā)表的布魯氏菌屬、種、型基因序列進(jìn)行分析，尋找出布魯氏菌種、型特異性基因分布規(guī)律，設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用VirB8-PCR，AMOS-PCR，B1-PCR方法對布魯氏菌屬、種、型進(jìn)行鑒定。與此同時(shí)，依據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）原理，建立Ery-PCR-SSCP

2、方法，用于牛種A19疫苗株與野毒株的區(qū)分鑒定。
　　 其次，以布魯氏菌致病力因子VirB7下游至VirB9上游基因序列為目的擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)上、下游引物，優(yōu)化血樣、奶樣中布魯氏菌基因組DNA的提取方法，建立布魯氏菌內(nèi)參PCR（IR-PCR）檢測方法，用于血液、奶液樣本中布魯氏菌的檢測，以達(dá)到降低普通PCR法在診斷布魯氏菌中的假陰性率。
　　 最后，對本實(shí)驗(yàn)室前期研制的布魯氏菌VirB8基因PCR試劑盒進(jìn)行組裝，并對試劑盒各

3、項(xiàng)特性（特異性、敏感性、保存期、可重復(fù)性）進(jìn)行評測。同時(shí)應(yīng)用該試劑盒對新疆、山西的2批65份血樣進(jìn)行了檢測，評估該試劑盒的臨床穩(wěn)定性。
　　 通過試驗(yàn)研究，獲得以下結(jié)果：1.VirB8-PCR，AMOS-PCR，B1-PCR方法能準(zhǔn)確檢測出布魯氏菌，并能對其種、型進(jìn)行鑒定；PCR-SSCP方法可將A19疫苗株與野毒株區(qū)分開來。2.內(nèi)參PCR方法在與細(xì)菌分離鑒定、血清學(xué)診斷的對比中，呈現(xiàn)出較高的陽性符合率（與細(xì)菌分離的陽性符合率為

4、100%，與iELISA的陽性符合率為62.5%），其對血樣、奶樣的檢出量分別為35CFU/ml、350CFU/ml，該方法適合于血樣、奶樣中布魯氏菌的檢測。3.VirB8-PCR診斷試劑盒在對布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株、疫苗株及65份送檢血樣進(jìn)行檢測中，能從SAT陰性血樣中檢測出2份陽性，表現(xiàn)其敏感性高于SAT，同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)每毫升血樣中含有布魯氏菌數(shù)量為35時(shí)即可被本試劑盒檢測出陽性結(jié)果，體現(xiàn)出本試劑盒較高的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：本試劑盒