動(dòng)物布魯氏菌快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、布魯氏菌病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。我國(guó)布魯氏菌病主要的診斷方法為細(xì)菌分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)（虎紅平板凝集和試管凝集試驗(yàn)），但滿足不了快速檢測(cè)的要求。本論文開(kāi)展布魯氏菌快速檢測(cè)方法的研究，從血清學(xué)抗體篩查→陽(yáng)性樣品的病原學(xué)檢測(cè)→病原的分型鑒定，建立系列的檢測(cè)方法，為布魯氏菌病凈化檢疫，提供快速有效地手段。
　　1．建立膠體金試紙檢測(cè)方法，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。根據(jù)雙抗原夾心法測(cè)抗體的原理，用葡萄球菌蛋白A和布魯氏菌

2、重組蛋白bp26抗原建立檢測(cè)布魯氏菌抗體的膠體金免疫層析試紙條。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性和陰性血清檢測(cè)結(jié)果正確，說(shuō)明該方法特異性較好。試紙條保質(zhì)期為4℃保存6個(gè)月。
　　2．建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，適用于檢測(cè)病原。以布魯氏菌屬OMP10保守片段為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman熒光探針。將OMP10基因片段克隆到pMD19-T載體，提取質(zhì)粒，制備標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線。特異性分析結(jié)果顯示，對(duì)照菌株均未出現(xiàn)熒光信號(hào)，說(shuō)明該方法特異

3、性較好；靈敏性分析表明，該方法最低檢出數(shù)量級(jí)為為10-4ng/μL；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同檢測(cè)時(shí)間、不同反應(yīng)管之間的域值的變化很小，組內(nèi)組間變異系數(shù)均小于2％。
　　3.建立布魯氏菌分型多重PCR方法，適用于病原進(jìn)行分型。根據(jù)布魯氏菌基因組多拷貝插入元件IS711及其下游多態(tài)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)布魯氏菌牛、羊、豬種分型引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，建立布魯氏菌分型的多重PCR方法。特異性分析結(jié)果顯示，對(duì)照菌株未見(jiàn)擴(kuò)增，說(shuō)明該