組織胺對(duì)新糠蝦和中華絨螯蟹的消化功能、免疫力以及卵巢發(fā)育的影響.pdf

1、中華絨螯蟹在養(yǎng)殖的過(guò)程中,魚(yú)粉和冰鮮野雜魚(yú)常常被作為飼料原料或直接投喂,由于在魚(yú)粉的制備工藝或者野雜魚(yú)的運(yùn)輸、儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)仍?往往會(huì)導(dǎo)致飼料或者野雜魚(yú)的變質(zhì)、腐敗,產(chǎn)生大量的生物胺。而組織胺作為毒性(scombroid poisoning)最大的一種生物胺,常被作為檢測(cè)魚(yú)粉質(zhì)量以及野雜魚(yú)的新鮮度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn),也是食品安全的重要檢測(cè)指標(biāo)。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)攝食組織胺飼料能夠影響甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng),存活以及性成熟,而消化、免疫以及性腺的發(fā)育是維持

2、其正常的生長(zhǎng)所必須的基礎(chǔ)。目前已有研究證實(shí),組織胺能夠引起魚(yú)以及家禽胃腸道疾病,而有關(guān)組織胺對(duì)甲殼動(dòng)物消化功能的影響未見(jiàn)報(bào)道。日本和黑褐新糠蝦常常作為毒性監(jiān)測(cè)的良好模式生物,而中華絨螯蟹存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)以及采樣的局限性,所以本文通過(guò)研究組織胺對(duì)日本新糠蝦消化、免疫以及卵巢發(fā)育影響進(jìn)行方法的探索,繼而為組織胺影響中華絨螯蟹的這些生理功能提供具體依據(jù),也是首次探索組織胺影響甲殼動(dòng)物消化、免疫以及卵巢發(fā)育的機(jī)理,也為冰鮮野雜魚(yú)的投喂提供科學(xué)的指

3、導(dǎo)。
　　(1)消化道和肝胰腺是甲殼動(dòng)物主要的消化器官,消化組織結(jié)構(gòu)的完整以及消化酶的正常分泌是維持消化功能的關(guān)鍵。通過(guò)投喂新糠蝦和中華絨螯蟹不同濃度的組織胺飼料(1000,2000和4000mg/kg組織胺)17d和28d,對(duì)消化道和肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的組織學(xué)分析以及消化酶測(cè)定,結(jié)果表明:
　　a.1000mg/kg組織胺均能夠?qū)е滦驴肺r和中華絨螯蟹肝胰腺上皮細(xì)胞嚴(yán)重的脫落、破損甚至基膜分離;4000mg/kg能夠引起其B-c

4、ell顯著增多以及管壁變薄,并且2000mg/kg組織胺能夠引起中華絨螯蟹肝胰腺F-cell和內(nèi)腔上皮細(xì)胞凸起的增多;
　　b.而對(duì)消化道的組織切片發(fā)現(xiàn),組織胺能夠?qū)е滦驴肺r中腸上皮細(xì)胞排列稀疏,破損甚至脫落,其中1000mg/kg濃度組尤為顯著;而4000mg/kg的組織胺能夠引起后腸的管壁變薄以及膜分離;對(duì)中華絨螯蟹的中腸以及后腸未見(jiàn)類(lèi)似影響,但是能夠引起其腸球中部嗜堿性細(xì)胞以及相連的網(wǎng)狀組織中的嗜伊紅細(xì)胞的變化,其中1000

5、mg/kg能夠減少其腸球中嗜堿性細(xì)胞和網(wǎng)狀組織中嗜伊紅細(xì)胞,而2000和4000mg/kg的組織胺能分別增加其網(wǎng)狀組織中的嗜伊紅細(xì)胞和腸球中的嗜堿性細(xì)胞,組織胺對(duì)其后腸結(jié)締組織中嗜伊紅細(xì)胞以及嵴也有影響,1000mg/kg的嗜伊紅細(xì)胞密度與對(duì)照組未見(jiàn)差異,但是能夠引起皺襞粘膜層中的嗜伊紅物質(zhì)的增加,而2000和4000mg/kg組的嗜伊紅密度降低。
　　c.對(duì)腸球以及后腸的細(xì)胞增殖的免疫組化發(fā)現(xiàn),組織胺能夠引起腸球以及后腸嵴中細(xì)胞

6、增殖陽(yáng)性,其腸球中的陽(yáng)性細(xì)胞的變化的規(guī)律與嗜堿性細(xì)胞規(guī)律一致,而嵴中的陽(yáng)性則與其嗜伊紅物質(zhì)一致。而肥大細(xì)胞是組織胺釋放的主要細(xì)胞,通過(guò)肥大細(xì)胞特異性染色(甲苯胺藍(lán)以及阿爾新藍(lán)-番紅染色法)發(fā)現(xiàn),其腸球中的嗜堿性細(xì)胞以及后腸結(jié)締組織中的嗜伊紅細(xì)胞均呈現(xiàn)甲苯胺藍(lán)以及阿爾新藍(lán)-番紅著染,并且腸球以及網(wǎng)狀組織中的顆粒呈現(xiàn)組織胺免疫陽(yáng)性,因此腸球以及后腸中存在類(lèi)肥大細(xì)胞的物質(zhì),可能通過(guò)組織胺的釋放影響腸道的組織結(jié)構(gòu)。
　　(2)類(lèi)胰蛋白酶,

7、淀粉酶以及脂肪酶是甲殼動(dòng)物主要的消化酶。通過(guò)飼喂以上濃度組織胺飼料28d,結(jié)果表明:
　　a.組織胺能夠影響肝胰腺和消化道的消化酶活性,并且肝胰腺中的影響較為顯著,即肝胰腺1000mg/kg組的類(lèi)胰蛋白酶和脂肪酶在7,14,21和28d均顯著低于對(duì)照組(p<0.05),而淀粉酶在7d和14d顯著低于對(duì)照組(p<0.05);消化道1000mg/kg組類(lèi)胰蛋白酶,淀粉酶以及脂肪酶僅分別在7d,7d~21d以及28d顯著低于對(duì)照組(p<

8、0.05)。
　　b.而肝胰腺中三種消化酶的影響中,類(lèi)胰蛋白酶的影響較大。在第7d時(shí),組織胺處理后的肝胰腺的類(lèi)胰蛋白酶的活性均較對(duì)照組(1.76±0.02)U/(mg.prot)有顯著降低(p<0.05),分別為對(duì)照組的27.00％(1000mg/kg)、71.79%(2000mg/kg)、57.75%(4000mg/kg),其中1000mg/kg組織胺投喂組,其酶活力較其他兩個(gè)組織胺組更為顯著,各組織胺組之間的酶活均存在顯著性差

9、異(p<0.05)。14~28d,除了4000mg/kg酶活性與對(duì)照組之間無(wú)顯著,其類(lèi)胰蛋白酶也均顯著低于對(duì)照組。而淀粉酶在7d和14d時(shí),組織胺處理后的酶活均低于對(duì)照組,并且具有顯著性差異(p<0.05);21d和28d時(shí),其淀粉酶活性與對(duì)照組不存在顯著性差異(p>0.05)。脂肪酶在7d的時(shí)候,組織胺組的脂肪酶活性均顯著低于對(duì)照組(p<0.05),但是各濃度組之間沒(méi)有顯著性差異,14~28d時(shí),僅低濃度組(1000mg/kg)與對(duì)照

10、組有顯著性差異(p<0.05)。
　　c.并且對(duì)肝胰腺類(lèi)胰蛋白酶進(jìn)行RT-PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)其組織胺對(duì)類(lèi)胰蛋白酶的影響與其mRNA基本一致。
　　(3)通過(guò)飼喂以及注射兩種方式對(duì)組織胺在中華絨螯蟹肝胰腺,肌肉中的累積發(fā)現(xiàn),注射組織胺濃度為0,1,50,100和200μg/g在96h內(nèi)能夠在肝胰腺和肌肉中出現(xiàn)累積,并且肝胰腺和肌肉中組織胺濃度與注射的濃度呈正比,而飼喂含0,1000,2000和4000mg/kg組織胺飼料28d。發(fā)

11、現(xiàn)肌肉中檢測(cè)不到組織胺,而肝胰腺中僅7d組織胺飼喂組組織胺含量均顯著高于對(duì)照組。對(duì)28d肌肉,肝胰腺以及血清組織胺主要的代謝酶二胺氧化酶(DAO)的酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn),肌肉中DAO的酶活顯著高于肝胰腺,這可能是肌肉中檢測(cè)不到組織胺的原因。說(shuō)明組織胺能夠在短期內(nèi)在體內(nèi)累積,并且短期內(nèi)組織胺能夠增加體內(nèi)章魚(yú)胺和5-HT的含量,對(duì)腐胺則影響無(wú)規(guī)律。
　　因此,組織胺能夠?qū)е赂我认偌?xì)胞(B-和F-細(xì)胞)比例發(fā)生變化以及消化道(中腸以及后腸等)

12、組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生損傷,細(xì)胞增殖,并且消化酶活性降低,其中1000mg/kg組織胺濃度組影響尤為顯著,組織胺從轉(zhuǎn)錄水平影響肝胰腺中類(lèi)胰蛋白酶的活性。而組織胺能夠在短期內(nèi)在體內(nèi)累積,并且短期內(nèi)組織胺能夠增加體內(nèi)章魚(yú)胺和5-HT的含量,對(duì)腐胺則影響無(wú)規(guī)律。
　　(4)通過(guò)對(duì)日本新糠蝦和黑褐新糠蝦對(duì)溶藻弧菌的敏感性以及血細(xì)胞形態(tài)和組成的比較,發(fā)現(xiàn)日本新糠蝦敏感性較高即96h的累積,而顆粒細(xì)胞比例要低于黑褐新糠蝦,但是其形態(tài)更多樣。因而對(duì)日本

13、新糠蝦的血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行光鏡和電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),其血細(xì)胞由三種類(lèi)型的細(xì)胞組成,即透明細(xì)胞,半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞組成,細(xì)胞大小依次升高,以顆粒細(xì)胞所占比例最多,約占細(xì)胞總數(shù)的一半,約為48%,其次為半顆粒細(xì)胞,其比例約為31%。比例最小的是透明細(xì)胞,僅約為21%,三組間均有顯著性差異(p<0.05),電鏡發(fā)現(xiàn)其顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中有大量的顆粒物質(zhì)。
　　組織胺水體(0,10,20和40mg/L)浸泡日本新糠蝦30d后,其血細(xì)胞中顆粒細(xì)胞的比例

14、顯著下降,而胞質(zhì)中的顆粒物質(zhì)明顯減少,并且40mg/L組織胺濃度組的顆粒細(xì)胞形態(tài)更加多樣性。組織胺處理之后,對(duì)其組織的免疫酶進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶菌酶和酚氧化酶活性隨組織濃度上升而顯著下降(p<0.05)而ACP和AKP的活性無(wú)顯著影響(p>0.05)。
　　注射中華絨螯蟹的濃度為0,1,50和100μg/g組織胺,1h后注射7.2×108cfu/ml,在12、24、36、48、72和96h的觀察其抵御嗜水氣單胞菌的死亡率,結(jié)果表明

15、
　　96h其組織胺濃度組的死亡率均顯著高于對(duì)照組(p<0.05),但是單獨(dú)的注射組織胺不會(huì)導(dǎo)致中華絨螯蟹死亡,卻能夠引起酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性升高(p<0.05),24h總的血細(xì)胞數(shù)目(THC)與對(duì)照組無(wú)顯著差異而磷酸酶(ACP和AKP)則無(wú)規(guī)律變化。注射組織胺后,中華絨螯蟹產(chǎn)生明顯的自切和顫抖現(xiàn)象,并且自切率隨著組織胺濃度的上升而上升(p<0.05)。
　　總之,組織胺能夠影響免疫酶以及血細(xì)胞的形

16、態(tài)和組成,提高對(duì)嗜水氣單胞菌的敏感性,產(chǎn)生自切現(xiàn)象,并且存在種間的差異性。
　　(5)對(duì)不同卵巢發(fā)育期的日本新糠蝦雌激素受體的免疫組化發(fā)現(xiàn),卵巢發(fā)育早期其卵母細(xì)胞的雌激素受體強(qiáng)烈陽(yáng)性,因此選取一期的中華絨螯蟹研究組織胺對(duì)其卵巢發(fā)育的影響。通過(guò)中華絨螯蟹注射組織胺的濃度為0,1,50,100和200μg/g后,96h取其卵巢,進(jìn)行組織學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),組織胺能夠影響中華絨螯蟹一期卵巢的卵細(xì)胞排列以及形態(tài),并且存在濃度的差異性。其中50μ