茶樹酯型兒茶素生物合成代謝相關(guān)酶檢測方法及初步純化研究.pdf

1、兒茶素是茶樹的重要次生代謝產(chǎn)物，不僅是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的主要化學(xué)成分，也是茶葉的主要藥理功能成分。其中酯型兒茶素的保健功能要高于非酯型兒茶素。茶樹中非酯型兒茶素的生物合成途徑業(yè)已清晰，但酯型兒茶素的合成代謝途徑及分子調(diào)控機(jī)理仍是研究難題。
　　 本課題前期工作發(fā)現(xiàn)，茶樹酯型兒茶素合成途徑包含兩步反應(yīng)，即沒食子酸(gallicacid,GA)先在UDPG的沒食子酰葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDPglucose:galloyl1OβDglucos

2、yltransferase，UGGT)作用下，形成1O沒食子酰βD葡萄糖(βG)。βG作為活化的沒食子供體，在表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶(epicatechin:1OgalloylβDglucoseOgalloyltransferase，ECGT)的作用下，將沒食子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到非酯型表兒茶素的C環(huán)3位點上，形成酯型兒茶素。同時酯型兒茶素也可以被茶樹中酯型兒茶素水解酶(galloylatedcatechinshydrolase,GCH)水解成

3、非酯型兒茶素和沒食子酸。
　　 本文以茶樹鮮葉為材料，研究GCH、UGGT和ECGT活性檢測體系的影響因素（包括最適反應(yīng)時間、最適溫度、最適pH、最適底物濃度），建立較為簡單的酶活性檢測方法，為進(jìn)一步分離純化酶蛋白，打下良好的基礎(chǔ)；并利用蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)對GCH進(jìn)行了初步純化。旨在為深入探討茶樹兒茶素合成及其代謝的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用高效液相色譜方法，對GCH、UGGT及

4、ECGT酶的酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性的檢測。
　　 2.建立了GCH、UGGT及ECGT三種酶的最適檢測體系。分別為：
　　 （1）GCH最適反應(yīng)體系：2.5mL反應(yīng)體系包括0.2mmol/LEGCG(ECG或GCG)，4mmol/L抗壞血酸，0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)，粗酶提取液若干(含0.4mg蛋白)，于30℃下反應(yīng)30min。
　　 （2）UGGT最適反應(yīng)體系：1.5mL反應(yīng)體系包括1.4mmo

5、l/LGA，2.3mmol/LUDPG，4mmol/L抗壞血酸，1.5mmol/L水楊酸，0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，粗酶提取液若干(含0.55mg蛋白)，于30℃下反應(yīng)90min。
　　 （3）ECGT最適反應(yīng)體系：1.5mL反應(yīng)體系包括0.38mmol/LEGC或EC，0.8mmol/L1O沒食子酰βD葡萄糖（βG），4mmol/L抗壞血酸，1.5mmol/L水楊酸，0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，粗