表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯水解酶的制備及應(yīng)用.pdf

1、茶多酚是一類多酚化合物的統(tǒng)稱,具有良好的生物活性,如抗氧化活性,抗腫瘤和抗突變性能。在生物體內(nèi)作為活性氧自由基清除劑,能夠降低癌癥,冠心病和動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)病率。綠茶中有五種主要茶多酚成分。由于不同結(jié)構(gòu)的茶多酚單體具有不同的生理活性,因此為了更為有效地利用各種單體以及在單體的基礎(chǔ)上研發(fā)新藥,從而充分發(fā)揮各自的效用,提純分離或合成茶多酚單體就顯得尤為重要。由于化學(xué)法合成產(chǎn)率較低且副產(chǎn)物多,分離純化困難,因此到目前為止,大多數(shù)的研究都是從

2、茶提取物中分離純化茶多酚單體。就表沒(méi)食子兒茶素(EGC)而言,由于EGC在茶葉中的含量低,約占綠茶茶多酚總量的5％,即使提取分離的效率再高,產(chǎn)量仍然受到制約。
　　表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)作為綠茶中茶多酚的主要成分,是EGC和沒(méi)食子酸(GA)形成的酯。因此如能通過(guò)水解技術(shù)將EGCG水解成EGC和GA將具有十分重要的市場(chǎng)前景。當(dāng)前,一些研究采用酸堿水解的常規(guī)化學(xué)方法處理EGCG,但水解率低,且EGCG和EGC在堿性條件下

3、不穩(wěn)定,極易被氧化。迄今為止,茶多酚生物轉(zhuǎn)化方面的研究較少,已有研究存在轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜以及EGCG和EGC在轉(zhuǎn)化條件下不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。所以建立一種將EGCG轉(zhuǎn)化為EGC的穩(wěn)定高效的生產(chǎn)方法變得格外重要和迫切。本研究建立了一種利用生物酶催化EGCG水解生產(chǎn)EGC的方法。本研究充分考慮到茶多酚單體在弱酸性條件下穩(wěn)定的特性,先是選取了適于弱酸性條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶的真菌;黑曲霉,米曲霉和里氏木霉作為產(chǎn)酶菌株,通過(guò)添加EGCG和橄欖油誘導(dǎo)產(chǎn)酶,

4、期望誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠催化生產(chǎn)EGC的EGCG水解酶,從而得到最佳生產(chǎn)菌種。
　　研究中利用薄層層析技術(shù)(TLC)和高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對(duì)水解反應(yīng)體系中產(chǎn)物和底物進(jìn)行分析驗(yàn)證。篩選得到EGCG-水解酶的菌株米曲霉和黑曲霉,其二者通過(guò)培養(yǎng)基中添加EGCG誘導(dǎo)產(chǎn)生EGCG水解酶;而未添加任何誘導(dǎo)劑和添加橄欖油的發(fā)酵液沒(méi)有EGCG水解酶活性;里氏木霉不具備產(chǎn)生EGCG水解酶的能力。此后,對(duì)黑曲霉和米曲霉兩株產(chǎn)EGCG水解酶的菌株進(jìn)一步

5、研究,研究。EGCG的添加及用量對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)酶的影響,并建立酶活測(cè)定方法和酶催化水解反應(yīng)體系等以確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間和得到最佳EGCG添加濃度,優(yōu)化產(chǎn)酶條件。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明;隨EGCG濃度的增加,各檢測(cè)指標(biāo)呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。EGCG濃度越高,pH值水平越低,殘?zhí)呛吭礁?菌體量越大;且各指標(biāo)的最大值出現(xiàn)的時(shí)間也越遲;蛋白含量和水解酶活力的變化趨勢(shì),黑曲霉與米曲霉有所不同。綜合體積酶活,比酶活和酶產(chǎn)率這幾項(xiàng)指標(biāo)對(duì)EGCG