蛋雞ALV-J的分離鑒定及分子致瘤機(jī)制的研究.pdf

1、ALV-J主要引起雞的骨髓細(xì)胞瘤(Myelocytoma)或骨髓白血病(MyeloidLeukosis，ML)和多種細(xì)胞類型的惡性腫瘤。近年來我國(guó)蛋雞群出現(xiàn)ALV-J感染病例的報(bào)道不斷增加，J亞群白血病已由最初肉用雞感染傳播向蛋雞和中國(guó)的許多地方品種雞發(fā)展，其宿主范圍正在不斷擴(kuò)大。另外，ALV-J的感染除了引起常見的髓樣細(xì)胞瘤外，還出現(xiàn)血管瘤、成髓細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、纖維肉瘤等多種組織的腫瘤，甚至同一雞群或同一雞體內(nèi)出現(xiàn)多種

2、腫瘤同時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象。
　　 目前國(guó)內(nèi)對(duì)J亞群白血病的研究，多偏向病原的分子病毒學(xué)和致病模型的病理形態(tài)學(xué)研究，未見從宿主靶細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因的變化來探討腫瘤的發(fā)病機(jī)制。我國(guó)當(dāng)前流行的ALV-J的組織嗜性、發(fā)病過程及致瘤機(jī)制的系統(tǒng)病理學(xué)研究少見報(bào)道，這方面的研究探討對(duì)揭示該病的病因?qū)W及發(fā)病學(xué)具有重要的理論意義。
　　 該研究旨在用從自然發(fā)病蛋雞群分離鑒定的ALV-J毒株人工接種5日齡SPF雞胚，建立ALV-J感染的動(dòng)物病理模型

3、，在不同時(shí)期剖殺試驗(yàn)雞，通過定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)雞群的病毒血癥、泄殖腔排毒及抗體陽(yáng)性率，動(dòng)態(tài)檢測(cè)靶組織腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)，觀察靶組織的病理變化及腫瘤演變過程，研究ALV-J的組織嗜性、致瘤機(jī)制及病理發(fā)生過程，豐富該病的病理學(xué)研究?jī)?nèi)容，進(jìn)而為該病的有效防制提供理論依據(jù)。
　　 本研究選擇山東、河南兩個(gè)表現(xiàn)為血管瘤兼髓細(xì)胞瘤型的蛋雞典型禽白血病病例，取病雞的病料，接種DF-1細(xì)胞(C/E)系，采用ELISA抗原檢測(cè)、PCR以及亞群特異性

4、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等方法，分離鑒定了二株ALV-J病毒，分別命名為hn10py01和sd10xt03。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的不同亞群序列設(shè)計(jì)合成3對(duì)連續(xù)、相互部分重疊的引物，完成了這兩株病毒前病毒全基因組核苷酸序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明：hn10py01和sd10xt03全基因組長(zhǎng)度分別為7652bp和7636bp，與已公開的ALV-J全基因組序列大小相比略有差異，但符合典型的復(fù)制完全型反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)，基因序列中不含已知致

5、癌基因。與國(guó)內(nèi)外各參考毒株進(jìn)行了同源性分析，兩毒株具有如下序列特征：(1)5’LTR和5’UTR與參考序列相比變異較大，hn10py015’UTRleader區(qū)有一個(gè)19bp的插入，兩株病毒在5’UTR區(qū)均有一個(gè)堿基的缺失；(2)3’UTR區(qū)rTM和DR區(qū)有一個(gè)連續(xù)的205bp的缺失，E元件相對(duì)保守，兩毒株均有一個(gè)堿基的缺失，形成新基序元件；(3)gag和pol基因非常保守；env基因變異較大，呈現(xiàn)高度多樣性，hn10py01有一個(gè)氨基

6、酸缺失。
　　 為研究蛋雞ALV-J分離株(hn10py01)的致病特性，接種5日齡SPF白菜航蛋雞雞胚，在感染后的第2、3、5、7、9、11、13、17、21、25、30、35周采集泄殖腔棉拭子、抗凝血、非抗凝血，進(jìn)行泄殖腔排毒、病毒血癥、ALV-J特異性抗體檢測(cè)；每次采樣時(shí)同時(shí)隨機(jī)取部分雞剖檢，進(jìn)行病理變化觀察。結(jié)果表明：(1)感染組雞只從第2周開始出現(xiàn)病毒血癥，并隨著日齡的增加，陽(yáng)性率不斷增加，11周后其陽(yáng)性率達(dá)到100％

7、，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；(2)感染組雞只從第2周開始排毒率不斷上升，在16周以后100％雞只排毒；(3)感染組雞只產(chǎn)生ALV-J抗體的陽(yáng)性率很低，最高達(dá)50％，后期快速下降至0；(4)感染組雞只產(chǎn)蛋后，蛋清內(nèi)p27陽(yáng)性率為100％，卵黃ALV-J抗體陽(yáng)性率為0；(5)能誘導(dǎo)感染雞發(fā)生骨髓瘤、血管瘤、骨髓瘤兼血管瘤和血管瘤兼纖維肉瘤多種類型腫瘤，腫瘤誘發(fā)率為25％。
　　 為研究癌基因、抑癌基因、凋亡基因及其它腫瘤相關(guān)基因在該病發(fā)病

8、學(xué)中的作用，本研究成功建立了原癌基因(c-myc、c-myb)、抑癌基因(p53、p16、p27)、凋亡調(diào)節(jié)基因(Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR)基因熒光定量PCR檢測(cè)方法，動(dòng)態(tài)檢測(cè)了抑癌基因、癌基因、凋亡基因和其它腫瘤相關(guān)基因在各臟器中的異常表達(dá)，對(duì)抑癌基因p53進(jìn)行了突變檢測(cè)，以探討ALV-J人工感染SPF雞的分子病理學(xué)發(fā)病機(jī)制。結(jié)果表明：感染組與對(duì)照組相比具有以下特征：(1)抑癌基因p53在各組織器

9、官內(nèi)(尤其是骨髓內(nèi))呈現(xiàn)高表達(dá)，p53的高表達(dá)與日齡關(guān)系不明顯，各時(shí)間段之間沒有明顯差異。感染雞高表達(dá)的p53基因主要為突變型，總突變率為60％以上，突變方式多種多樣。7例標(biāo)本同時(shí)存在兩個(gè)以上位點(diǎn)的突變，DNA結(jié)合部位外顯子的點(diǎn)突變率為51.6％，C-末端外顯子的點(diǎn)突變率為17.3％；缺失突變?yōu)?0.7％，N-末端外顯子突變率為0.5％，p53基因突變和過量表達(dá)可能是使靶細(xì)胞癌變的重要原因；(2)感染組抑癌基因p16呈失表達(dá)，抑癌基因p

10、27呈低表達(dá)；(3)凋亡基因bcl-2在攻毒早期(3H齡前)，各組織呈現(xiàn)高表達(dá)，隨著日齡的增加bcl-2的表達(dá)水平與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異；(4)原癌基因c-myc在骨髓、肝和脾內(nèi)表達(dá)升高，但未檢測(cè)到插入突變；(5)感染組雞只組織與血液中的VEGF及其受體基因隨著日齡的增加表達(dá)量也有一定程度的增加。
　　 根據(jù)九種腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果，J亞群禽白血病腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)，可能與抑癌基因p53變異及高表達(dá)、抑癌基因p16失活及

11、p27的低表達(dá)、原癌基因c-myc激活、凋亡基因Bcl-2的過表達(dá)及VEGF基因和其受體基因(FLT1、Flk1/KDR)的過表達(dá)密切相關(guān)。
　　 本研究還據(jù)獲得的突變型p53基因和野生型p53基因，構(gòu)建了pEGFP-C1-p53和PCAGGS-p53真核表達(dá)載體，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光、westernblot、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察等檢測(cè)方法，證實(shí)兩種真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選和進(jìn)