一株ALV-J全基因序列分析及其RNAi重組腺病毒與DNA疫苗的試驗(yàn)研究.pdf

1、禽白血病(avian leukosis，AL)是一種能引起禽類免疫抑制的腫瘤性疾病，由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起，其中J亞型禽白血病病毒(subgroup J ALV, ALV-J)是目前養(yǎng)雞業(yè)最為常見(jiàn)、危害最為嚴(yán)重的亞群。雞群感染ALV后，可能會(huì)出現(xiàn)生產(chǎn)性能降低、免疫水平下降、出血、腫瘤和生長(zhǎng)遲緩等病癥。目前并沒(méi)有很好的預(yù)防和治療ALV感染的疫苗和藥物，主要依賴種群的凈化。為了輔助凈化工作，課

2、題組構(gòu)建了一個(gè)DNA疫苗和一個(gè)RNAi的重組腺病毒，本課題將通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證它們的實(shí)際效果。另外從臨床發(fā)病雞分離鑒定了一株ALV-J并進(jìn)行了全基因序列分析。
　　本課題從廣東某雞場(chǎng)臨床發(fā)病的病雞體內(nèi)采集病料，應(yīng)用DF-1細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物的IFA、ELISA和PCR檢測(cè)，確定獲得一株ALV-J，命名為GDMM。通過(guò)特異性引物擴(kuò)增獲得并完成了對(duì)該分離株的全基因組序列測(cè)定，經(jīng)與14個(gè)來(lái)自兩廣地區(qū)的分離株及國(guó)內(nèi)其他地方的參

3、考株進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與廣西分離株GX14ZS14、GX14HG04及廣東參考株GDQY1201等之序列的相似性很高，尤其與GX14ZS14株的核苷酸相似性高達(dá)96.8％，且系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與GX14ZS14親緣關(guān)系最近，同屬一分支。
　　為驗(yàn)證課題組制備的RNAi重組腺病毒pAd-gp85-shRNA2對(duì)雞體內(nèi)ALV-J感染的干擾效果，選擇蛋清p27抗原陽(yáng)性且血漿病毒分離呈陽(yáng)性的種雞群作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中實(shí)驗(yàn)組(28只產(chǎn)蛋母雞

4、)接種重組腺病毒100μL(1.6×109PFU)/只、對(duì)照組(28只產(chǎn)蛋母雞)注射PBS100μL。分別檢測(cè)試驗(yàn)前后母雞的體重、其后代雛雞胎糞的p27抗原陽(yáng)性率;同時(shí)在試驗(yàn)后采集母雞的蛋清進(jìn)行p27抗原檢測(cè)和抗凝血進(jìn)行病毒分離培養(yǎng);接種后每周采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只母雞的抗凝血和分泌物，對(duì)ALV-J和重組腺病毒分別進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組母雞的體重?zé)o顯著差異;實(shí)驗(yàn)組母雞蛋清p27抗原陽(yáng)轉(zhuǎn)陰和血毒陽(yáng)轉(zhuǎn)陰的個(gè)體均為25％，后

5、代雛雞胎糞p27抗原陽(yáng)轉(zhuǎn)陰的個(gè)體有19％;在接種后2w，母雞體內(nèi)的ALV-J拷貝數(shù)最少、重組腺病毒對(duì)ALV-J的干擾效率也最高，可達(dá)68％;接種后4w，母雞體內(nèi)仍可檢測(cè)到重組腺病毒，與接種后4w時(shí)實(shí)驗(yàn)組ALV-J拷貝數(shù)比對(duì)照組少的結(jié)果相一致，說(shuō)明重組腺病毒在接種后4w仍能對(duì)母雞體內(nèi)的ALV-J發(fā)揮干擾作用。
　　為驗(yàn)證課題組構(gòu)建的DNA疫苗pVAX1-Ub1-gp85-p27-p10誘導(dǎo)接種母雞產(chǎn)生抗體及其后代雛雞產(chǎn)生母源抗體的效

6、果，選擇蛋清p27抗原檢測(cè)陰性且ALV-J抗體也是陰性的產(chǎn)蛋母雞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)組(25只產(chǎn)蛋母雞)接種DNA疫苗、對(duì)照組(25只產(chǎn)蛋母雞)注射PBS，2w后以同樣劑量重復(fù)注射一次。試驗(yàn)前后分別稱量母雞的體重、檢測(cè)免疫母雞血清中的抗體及其后代雛雞血清中ALV-J的母源抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組母雞的體重?zé)o顯著差異，有28％的免疫母雞(7只)和8％(2只)母雞之后代小雞的抗體出現(xiàn)陰轉(zhuǎn)陽(yáng)。
　　本課題研究的結(jié)果表明，從臨床發(fā)病雞