lncRNA與mRNA在雞ALV-J病毒感染中的表達(dá)規(guī)律研究.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarocma Virus，RSV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。在家禽生產(chǎn)中，該疾病主要引起雞群產(chǎn)蛋率下降、死亡率上升、肉品質(zhì)降低，同時(shí)嚴(yán)重影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)出中樞免疫器官萎縮和抵抗力明顯下降，繼而增加其他疾病的感染幾率。近年來，ALV-J作為一種主要流行的禽白血病病毒，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的

2、健康發(fā)展，給中國(guó)乃至世界養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，至今還沒有有效控制禽白血病的疫苗和藥物。目前主要通過種群凈化來控制疾病，但這種方法存在著成本高、周期長(zhǎng)、受外界環(huán)境影響大等弊端。因此，迫切需要從遺傳上探明ALV-J的感染機(jī)制以及尋找防治ALV-J的方法。本研究利用Illumina HiSeq2500高通量測(cè)序技術(shù)，分別在體內(nèi)和體外水平對(duì)ALV-J感染的雞源細(xì)胞以及病雞組織樣進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出病毒感染過程中的關(guān)鍵差異mRNA和ln

3、cRNA，探討lncRNA在病毒感染過程中的可能作用機(jī)制，從而為尋找禽白血病的腫瘤標(biāo)記物以及家禽抗病育種提供理論基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、為探討雞免疫細(xì)胞和體細(xì)胞感染ALV-J后病毒復(fù)制與宿主細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，本研究利用雞巨噬細(xì)胞(HD11)與成纖維細(xì)胞(CEF)為素材，分別接種100個(gè)TCID50的ALV-J病毒，并在1dpi、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi、7dpi檢測(cè)了細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋

4、亡率三個(gè)指標(biāo)。結(jié)果表明，CEF細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)在4dpi時(shí)顯著上升(P＜0.05)，HD11細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)在5dpi時(shí)出現(xiàn)顯著上升(P＜0.05）;CEF細(xì)胞活力在5dpi后出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），而HD11細(xì)胞則在4dpi前顯著上升(P＜0.05）;兩種細(xì)胞的凋亡率均是隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在3dpi時(shí)達(dá)到最大，隨后出現(xiàn)下降。
　　2、基于細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，我們選取了1dpi、4dpi、7dpi三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，利用RNA-s

5、eq技術(shù)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，我們分別獲得了336和269個(gè)差異表達(dá)基因。經(jīng)過熒光定量驗(yàn)證后將這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路與免疫反應(yīng)相關(guān)，如先天性免疫反應(yīng)（OASL，CCL4），適應(yīng)性免疫反應(yīng)(LYZ,CD72），凋亡與自噬（WISP2,COMP），炎癥反應(yīng)(JSC,IL8），腫瘤形成相關(guān)(PCNA，GPX3）。
　　3、為挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的lncRNA信息，利用cuffinks等

6、生物信息學(xué)軟件對(duì)lncRNA進(jìn)行了比對(duì)、預(yù)測(cè)，共獲得了12103條lncRNA。通過對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行順式(Cis)和反式(Trans)預(yù)測(cè)，在CEF細(xì)胞中，差異lncRNA所預(yù)測(cè)的靶基因被富集到多個(gè)與先天性免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路中(ISG15-protein conjugation，innate immune response);而在HD11細(xì)胞中，多被富集到血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)等通路(negative regulatio

7、n of autophagy，T cell activation)。通過IncRNA與mRNA共表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)NONGGAT007033.2，TCONS_00143593，TCONS_00286311等多個(gè)lncRNA與CNN2, MMP2, CD72, CCL4, IL-1等免疫相關(guān)基因存在顯著共表達(dá)關(guān)系。
　　4、為了進(jìn)一步探索ALV-J在機(jī)體感染中的轉(zhuǎn)錄組變化情況，從實(shí)際生產(chǎn)中篩選出只感染ALV-J與健康個(gè)體各3只，對(duì)其脾臟