豬鏈球菌2型SLY基因在畢赤酵母中的表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus，S.suis）是一種重要的人畜共患病病原，豬感染鏈球菌病的癥狀表現(xiàn)不一，高致病性菌株感染豬會(huì)導(dǎo)致豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥、流產(chǎn)和突然死亡等疾病。根據(jù)莢膜多糖抗原將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型(SS2)致病性強(qiáng)、流行廣，是最主要的致病原。豬鏈球菌2型含有多種毒力因子，如莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、胞外因子(EF)、豬溶血素(SLY)和IgG結(jié)合蛋白等。

2、其中豬鏈球菌溶血素屬于巰基激活類(lèi)細(xì)胞毒素家族，能與宿主細(xì)胞受體結(jié)合而導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加并裂解，證實(shí)溶血素具有細(xì)胞毒性，并能阻斷補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷和吞噬作用。因此有學(xué)者認(rèn)為溶血素可能是亞洲和歐洲豬鏈球菌2型最重要的毒力相關(guān)因子。本試驗(yàn)的目的:構(gòu)建溶血素基因的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)得到溶血素蛋白，分析表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性，為豬鏈球菌2型疫苗研究做基礎(chǔ)，并進(jìn)一步免疫SPF兔得到抗血清，可用于制作單特異性抗血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也可應(yīng)用于疫苗的

3、評(píng)定。本研究通過(guò)分子克隆和酵母表達(dá)等方法獲得以下結(jié)果:
　　 1、對(duì)豬鏈球菌SS2/C55606株溶血素基因序列和表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行序列分析并設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出溶血素基因，并通過(guò)酶切、連接到表達(dá)載體pPICZαA上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組質(zhì)粒pPICZαA-SS2/C55604-SLY。
　　 2、將重組載體進(jìn)行SacⅠ酶切后，得到線(xiàn)性化質(zhì)粒，用試劑盒進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母感受

4、態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性菌株的篩選和酵母基因的PCR鑒定，得到DNA重組畢赤酵母菌株。
　　 3、使用DNA重組畢赤酵母菌株進(jìn)行溶血素基因誘導(dǎo)，優(yōu)化條件為:溫度28.5℃，甲醇濃度第1d1％、之后每天2％。在第5d(108h)收獲上清，并超濾至原體積的1/10～1/5，得到濃縮蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、溶血試驗(yàn)和間接ELISA鑒定，確定其為溶血素蛋白，且活性很高，進(jìn)一步純化可用于疫苗的研究。
　　 4、對(duì)得到的蛋