應(yīng)用豬口腔液進(jìn)行PRRSV中和抗體監(jiān)測及納米顆粒候選疫苗的評(píng)估.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)自1991年被鑒定以來,已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病,目前在世界范圍內(nèi)每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成上億經(jīng)濟(jì)損失。口腔液是一種唾液和黏膜滲出液的混合物,包含來自血清和唾液腺的抗體。由于采集簡單、費(fèi)用低廉,用口腔液進(jìn)行豬場疫病監(jiān)測得到越來越多的應(yīng)用。
　　PRRSV特異性中和抗體在病毒的清除中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)也是評(píng)估豬群 PRRS免疫保護(hù)水平的主要指標(biāo)。有研究證明可以從豬口腔液樣品中檢測到PRRSV病

2、原和病毒特異性抗體。但是,迄今為止,應(yīng)用豬口腔液來檢測PRRSV中和抗體仍是空白。因此,本研究旨在建立一種應(yīng)用豬口腔液進(jìn)行PRRSV特異性中和抗體檢測的試驗(yàn)方法。首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn),口腔液樣品主要來自兩個(gè)方面:豬場免疫PRRSV弱毒疫苗(PRRSV-MLV)后為期三個(gè)月間斷性采集的口腔液樣品;公豬免疫 PRRSV-MLV或感染PRRSV-MN184當(dāng)天及第21天采集的口腔液和血清樣品。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)口腔液中PRRSV中和抗體滴度大于1:

3、8時(shí)是病毒特異的,而這種特異性中和抗體只有在免疫或者感染28天后才能從口腔液中檢測到。為了驗(yàn)證該試驗(yàn)方法,從一個(gè)背景未知的豬場,采集了以欄為單位的口腔液樣品共104份以及每欄有代表性的血清樣品5份;另外,從4個(gè)不同育種豬場中,采集重復(fù)免疫的母豬血清樣品以及對(duì)應(yīng)母豬產(chǎn)下仔豬的口腔液樣品各100份。檢測結(jié)果顯示,口腔液中的PRRSV中和抗體滴度與血清中和抗體滴度相關(guān),可以從斷奶后仔豬的口腔液樣品中檢測到 PRRSV特異性母源中和抗體。

4、>　　當(dāng)前現(xiàn)有的PRRSV商品化疫苗均存在不同的弱點(diǎn),不能對(duì)豬群提供完全保護(hù),開發(fā)新型PRRSV疫苗的研究仍在不斷進(jìn)行。本研究的另外一個(gè)目標(biāo)是探索口腔液在實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)估候選疫苗效果時(shí)的作用。以二乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI)滅活PRRSV-VR2332病毒,選擇性的將滅活的病毒抗原與荊豆凝集素(Ulex Europaeus Agglutinin, UEA)一起包埋于聚乳酸-聚羥乙酸(poly lactid

5、e-co-glycolide,PLGA)中,制成納米顆粒疫苗,然后將納米顆粒疫苗分別與4種候選佐劑共同免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,經(jīng)2次鼻內(nèi)噴霧接種后,用 PRRSV-MN184進(jìn)行攻毒試驗(yàn)以評(píng)價(jià)疫苗的交叉免疫保護(hù)能力。通過對(duì)黏膜相關(guān)組織(肺,支氣管淋巴結(jié),支氣管肺泡灌洗液),血清以及口腔液的免疫相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),第8試驗(yàn)組滅活 VR2332納米顆粒疫苗與4號(hào)佐劑(NP-VR+Adjuvant4)產(chǎn)生的免疫效果較好,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以獲得較好的交叉保護(hù),具體

6、表現(xiàn)為:(1)黏膜相關(guān)組織的PRRSV RNA拷貝數(shù)低,攻毒后第9天血清中的PRRSV被完全清除,攻毒后第15天口腔液中病毒RNA檢測結(jié)果陰性;(2)肺和支氣管肺泡灌洗液中檢測到高滴度的PRRSV中和抗體,攻毒后第15天可以在口腔液中檢測到中和抗體;(3)肺和支氣管肺泡灌洗液中 PRRSV特異性 IgG應(yīng)答顯著增強(qiáng),血清和口腔液中呈現(xiàn)高水平的IgA和IgG應(yīng)答。這是應(yīng)用口腔液樣品與血清等其它樣品一起篩選候選疫苗的首次嘗試,口腔液中的PR

7、RSV RNA拷貝數(shù),中和抗體滴度和特異性IgA和IgG反應(yīng)等結(jié)果為疫苗的免疫效果評(píng)估提供了重要參考價(jià)值。
　　本研究建立了一種以豬口腔液為樣品檢測 PRRSV特異性中和抗體的實(shí)驗(yàn)方法,其特異性和重復(fù)性分別達(dá)到94.3％和90.5%。本研究還通過口腔液中的PRRSV RNA拷貝數(shù),中和抗體滴度和特異性IgA和IgG反應(yīng)對(duì)候選納米顆粒疫苗的免疫效果進(jìn)行了評(píng)估,而這些試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)是有效的。因此,豬的口腔液可作為PRR