糖皮質(zhì)激素受體通路在共軛亞油酸誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織減少以及二花臉豬高皮質(zhì)醇耐受中的作用.pdf

1、本研究分為兩部分。
　　第一部分
　　糖皮質(zhì)激素受體通路在共軛亞油酸誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織減少中的作用
　　共軛亞油酸(CLA)已作為食品添加劑廣泛使用，但能夠引起小鼠的脂肪營(yíng)養(yǎng)不良等機(jī)體的代謝紊亂。我們以往發(fā)現(xiàn)CLA能夠顯著降低圍脂滴蛋白(perilipin1)的表達(dá)，并引起小鼠脂肪組織的異常脂解。因此本實(shí)驗(yàn)的目的就是為了進(jìn)一步探討CLA引起小鼠脂肪組織plin1異常下降的原因。我們對(duì)Plin1基因上游的糖皮質(zhì)激素受體(

2、GR)進(jìn)行了研究。首先在兩組(n=12)6周齡雄性昆明小鼠的日糧中分別添加1.5％的CLA（試驗(yàn)組）或亞油酸(LA，對(duì)照組)，13天后誘導(dǎo)出脂肪組織減少，測(cè)定血漿中皮質(zhì)醇(cortisol)的含量，檢測(cè)小鼠附睪脂肪組織中GR的mRNA水平，并且分別克隆小鼠GR啟動(dòng)子和帶有GRE的Plin1啟動(dòng)子，讓這些啟動(dòng)子控制熒光素酶基因，構(gòu)建pGL3-GR和pGL3-Plin1(GRE)重組質(zhì)粒。在Hela細(xì)胞中檢測(cè)地塞米松(DEX)對(duì)GR啟動(dòng)子活

3、性的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)CLA對(duì)DEX刺激后GR啟動(dòng)子的影響，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了DEX對(duì)Plin1啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，飼喂CLA的小鼠的血漿中的cortisol含量顯著下降(P＜0.05)，熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)附睪脂肪組織中GR的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染GR啟動(dòng)子的Hela細(xì)胞中，DEX能使GR啟動(dòng)子的活性顯著升高(P＜0.05)，但是CLA的添加則會(huì)抑制這

4、種反應(yīng)。在轉(zhuǎn)染Plin1（含GRE）啟動(dòng)子的Hela細(xì)胞培養(yǎng)液中添加DEX則能顯著增加Plin1（含GRE）啟動(dòng)子活性(P＜0.01)。以上結(jié)果表明:CLA不僅能夠使小鼠體內(nèi)皮質(zhì)醇(cortisol)含量下降，而且能使GR的表達(dá)下降;體外試驗(yàn)表明，CLA通過(guò)抑制GR啟動(dòng)子的活性進(jìn)而抑制GR的表達(dá)，Dex能夠增加Plin1啟動(dòng)子的活性。CLA通過(guò)抑制cortisol含量和GR的表達(dá)從而抑制GR靶基因Plin1的表達(dá)，從而導(dǎo)致脂肪組織異常脂

5、解，最終引起脂肪減少。
　　第二部分
　　糖皮質(zhì)激素受體通路在二花臉豬高皮質(zhì)醇耐受中的作用
　　糖皮質(zhì)激素(GC)通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合在動(dòng)物的生理代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道，在同等的運(yùn)輸應(yīng)激的條件下，二花臉和皮特蘭豬的應(yīng)激反應(yīng)變現(xiàn)差異，二花臉豬并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)，皮特蘭豬的應(yīng)激反應(yīng)比較強(qiáng)烈，通過(guò)檢測(cè)兩品種豬血清中的皮質(zhì)醇(cortisol)含量發(fā)現(xiàn)，二花臉的cortisol含量顯著高于皮特蘭豬

6、。另有報(bào)道，在基礎(chǔ)代謝的條件下，二花臉豬血清中的cortisol含量也約是大白豬的2倍。兩種不同的實(shí)驗(yàn)共同表明二花臉豬體內(nèi)存在高皮質(zhì)醇耐受的現(xiàn)象，GR信號(hào)的傳導(dǎo)通路發(fā)生了障礙。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的就是為了研究二花臉高皮質(zhì)醇耐受產(chǎn)生的機(jī)制。首先本實(shí)驗(yàn)取4-5周齡的二花臉和大白豬，處死后取血制備血清檢測(cè)cortisol的含量。P65作為NF-κB基因的亞基，在GR的信號(hào)通路中能夠與GR競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合某種蛋白從而降低GR靶基因的表達(dá)。然后本實(shí)驗(yàn)取

7、兩品種豬的肝臟組織，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)GR基因及P65基因的信使核苷酸(mRNA)水平的表達(dá)差異性。為了進(jìn)一步研究二花臉豬應(yīng)激不敏感的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)克隆了GR下游的靶基因Plin1基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子上含有GRE序列，讓這一啟動(dòng)子控制熒光素酶基因的表達(dá)，構(gòu)建pGL3-pigPlin1（GRE）重組質(zhì)粒，在Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒，用地塞米松(DEX)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)其熒光素酶報(bào)告基因的活性;共轉(zhuǎn)染Plin1(GRE)

8、啟動(dòng)子和P65，用Dex刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的活性。結(jié)果顯示:二花臉豬血清中的cortisol含量顯著高于大白豬(P＜0.05)，前者約是后者的兩倍;在mRNA水平上，二花臉豬的肝臟組織的GR基因和P65基因都顯著高于大白豬。在體外試驗(yàn)中，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，Dex刺激使GR靶基因啟動(dòng)子Plin1的活性升高，在Dex的刺激條件下，P65與GR靶基因啟動(dòng)子Plin1的共轉(zhuǎn)染顯著降低了GR靶基因的表達(dá)(P＜0.05)。以上結(jié)