低溫脅迫下番茄PSⅡ捕光天線蛋白基因LeLhcb2的功能分析.pdf

1、低溫是一個嚴(yán)重的環(huán)境脅迫因子，它影響作物的生長發(fā)育，并導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的降低。低溫脅迫下植物光合碳同化能力下降，即便是在弱光條件下也會產(chǎn)生過剩光能，致使活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量積累，引起植物光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)的光抑制，甚至光氧化。植物在進(jìn)化過程中，形成了多種防御機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境的變化，包括PSⅡ捕光天線蛋白調(diào)節(jié)光能在兩個光系統(tǒng)間的分配，促進(jìn)過剩光能的耗散，降低ROS的積累

2、，從而保護(hù)植物光合機(jī)構(gòu)免受過剩激發(fā)能的破壞。因此，探討低溫脅迫下捕光色素蛋白復(fù)合體(LHC)蛋白對植物低溫抗性的影響具有重要的理論意義和實踐價值。
　　本實驗從番茄品種中蔬6號葉片中分離到了一個PSⅡ捕光天線蛋白基因LeLhcb2，并以過表達(dá)該基因的煙草為材料，研究了過表達(dá)LeLhcb2對轉(zhuǎn)基因煙草低溫耐性的影響，主要結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)NCBI查得葉綠素a/b綁定蛋白基因的全長mRNA序列（GenBank注冊號:AK

3、246535.1）。利用DNAman軟件設(shè)計特異引物，RT-PCR的方法獲得基因的全長cDNA。該基因全長892bp，開放閱讀框798bp，編碼266個氨基酸。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谌~綠素a/b綁定蛋白超家族，具有葉綠素a/b綁定結(jié)構(gòu)域。與擬南芥12個葉綠素a/b綁定蛋白比對結(jié)果顯示該基因氨基酸序列與擬南芥AtLhcb2同源性最高（約88％）。與GenBank中其它已知植物L(fēng)HCB2氨基酸序列比對結(jié)果

4、顯示該基因氨基酸序列與鹽芥、衣藻、豌豆、楊樹、景天以及卷柏等植物的LHCB2高度同源。DNAman軟件聚類分析結(jié)果顯示，番茄的LHCB2與楊樹和景天的LHCB2最為聚類。以上結(jié)果顯示我們克隆到的基因是番茄PSⅡ捕光天線蛋白基因Lhcb2，我們將其命名為LeLhcb2。
　　(2)擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)p35S-LeLhcb2-GFP融合蛋白，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明Le

5、Lhcb2蛋白定位于葉綠體。
　　(3)半定量PCR和Northern雜交分析表明，LeLhcb2基因在葉片中表達(dá)量最高。qRT-PCR和Northern雜交分析表明LeLhcb2的表達(dá)受4℃、NaCl誘導(dǎo)，受滲透脅迫和氧化脅迫抑制。此外，LeLhcb2的表達(dá)還受到信號物質(zhì)的影響。
　　(4)成功構(gòu)建了pET-LeLhcb2原核表達(dá)載體，用IPTG誘導(dǎo)LeLhcb2在大腸桿菌BL21中表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白純化后免疫小鼠，制

6、備抗體，測得效價為1∶10000， Western雜交表明，低溫和高鹽均誘導(dǎo)LeLhcb2在蛋白水平的表達(dá)。
　　(5)將LeLhcb2的編碼區(qū)連入pBI121載體，構(gòu)建了LeLhcb2的過表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得正義轉(zhuǎn)基因煙草植株，并通過PCR、qRT-PCR以及Western雜交的方法檢測具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明成功獲得了LeLhcb2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
　　(6)正常生長條件下，野生型

7、與正義轉(zhuǎn)基因植株表型上無明顯差別。但是，低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)正義基因煙草幼苗的存活率和生長量優(yōu)于野生型，表現(xiàn)出更高的鮮重和葉綠素含量。低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草成苗也表現(xiàn)出更好的生長表型。體現(xiàn)在較高的凈光合速率(Pn)和較低的細(xì)胞膜受傷害程度。這些結(jié)果表明過表達(dá)LeLhcb2基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的低溫耐性。
　　(7)在低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)正義煙草植株與野生型相比，表現(xiàn)出較高的Fv/Fm，NPQ和D1蛋白含量，說明轉(zhuǎn)基因煙草PSⅡ的光