番茄葉綠體DnaJ蛋白SlCDJ2的功能分析.pdf

1、番茄是一種起源于熱帶的喜溫蔬菜作物，但其對(duì)高溫的抗性并不強(qiáng)，而高溫通常伴隨著干旱，這兩種脅迫嚴(yán)重時(shí)會(huì)使番茄結(jié)實(shí)率低下，造成減產(chǎn)。因此，研究番茄的高溫、干旱抗性具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。另外，番茄在環(huán)境變化時(shí)，又極易染病，嚴(yán)重時(shí)，造成番茄果實(shí)大面積腐爛，減產(chǎn)。同樣，對(duì)番茄抗病性的研究也具有現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），光合作用受到抑制。DnaJ蛋白作為一種廣泛的脅迫響應(yīng)因子，它具

2、有獨(dú)自或協(xié)助 Hsp70完成蛋白質(zhì)折疊、解折疊、聚合和調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等功能，在逆境脅迫下蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體穩(wěn)定性的維持方面發(fā)揮重要作用。因此，研究逆境脅迫下番茄DnaJ蛋白的功能，具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究克隆了一個(gè)番茄葉綠體定位的DnaJ蛋白基因（SlCDJ2），并以轉(zhuǎn)正、反義SlCDJ2的番茄和過表達(dá)SlCDJ2的煙草為材料，探討了轉(zhuǎn)SlCDJ2基因番茄在高溫脅迫下維持Rubisco活性和轉(zhuǎn)SlCDJ2基因

3、煙草在干旱和病原菌脅迫下ROS清除能力等方面的功能，主要結(jié)果如下：
　?。?）從番茄葉片中分離得到SlCDJ2（GenBank序列號(hào)：AK323942.1），該基因全長(zhǎng)為1159bp，開放閱讀框?yàn)?34bp，編碼277個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)分子量為32.7kDa，等電點(diǎn)為9.30。該基因位于番茄12號(hào)染色體上。
　?。?）RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，SlCDJ2在番茄的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)量最高，同時(shí)，高溫、

4、干旱、SA和病原菌均可誘導(dǎo) SlCDJ2表達(dá)。經(jīng)過western blot進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SlCDJ2明顯受到42℃的誘導(dǎo)表達(dá)。
　?。?）構(gòu)建SlCDJ2-GFP融合蛋白，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過Confocal觀察發(fā)現(xiàn)SlCDJ2蛋白定位于葉綠體。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示SlCDJ2蛋白均勻地分布在葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上。
　?。?）構(gòu)建了pET-SlCDJ2原核表達(dá)載體，成功誘導(dǎo)SlCDJ2在大腸桿

5、菌BL21中表達(dá)，并將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)純化后免疫小鼠，制備抗體，測(cè)得效價(jià)為1:10000，用于接下來的western blot實(shí)驗(yàn)。
　?。?）酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SlCDJ2可以與番茄葉綠體定位的cpHsp70互作。
　?。?）將SlCDJ2的編碼區(qū)連入pBI121載體，構(gòu)建了SlCDJ2的過表達(dá)和抑制表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，獲得正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株，同時(shí)，將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，獲得過表達(dá)SlCDJ

6、2煙草植株。并通過PCR、qRT-PCR以及western雜交的方法檢測(cè)具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明成功獲得了SlCDJ2過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株和轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　?。?）高溫脅迫下，過表達(dá) SlCDJ2番茄具有較高的CO2同化速率、Rubisco活性和Rubisco大亞基含量。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)高溫處理后，衰老誘導(dǎo)表達(dá)的幾個(gè)基因（SENU3、SlSGR1、LX、RbcL、RbcS、PsbA）在轉(zhuǎn)基因和WT番

7、茄中均發(fā)生了相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。此外，蛋白水解酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高溫處理后，反義植株水解酶活性明顯高于WT和正義植株，說明SlCDJ2可能通過維持較低的蛋白水解酶活性來緩解 Rubisco的降解速度，進(jìn)而緩解光合作用所受的抑制。
　?。?）在干旱脅迫下，過表達(dá)SlCDJ2能減少轉(zhuǎn)基因煙草H2O2和O2-的積累。與Vec植株相比，轉(zhuǎn)基因植株具有相對(duì)較高的最大光化學(xué)效率、凈光合速率和D1蛋白含量。因此，過表達(dá)SlCDJ2能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙