豬流行性腹瀉病毒對細胞微絲骨架及緊密連接的影響.pdf

1、微絲是支撐細胞的蛋白纖維網(wǎng)架系統(tǒng)，在細胞遷移、胞內物質運輸?shù)燃毎顒又衅鸨夭豢缮俚淖饔谩２《咀鳛閲栏竦陌麅燃纳?，為了?chuàng)造有利于自身入侵、復制和釋放的環(huán)境，進化了多種與宿主細胞骨架相互作用的機制，從而達到順利入侵、準確到達復制位點進行高效復制、以及快速、遠距離傳播的目的。而細胞微絲被干擾后，細胞內病毒的活動也會受到明顯抑制。廣義上的微絲骨架也包括緊密連接蛋白部分。豬流行性腹瀉是一種急性、接觸性、高度傳染性消化道疾病，近年來給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨

2、大經濟損失。本文以豬小腸上皮細胞系IPEC-J2為試驗對象，首次研究豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)與宿主細胞微絲骨架之間的相互作用，以及其對緊密連接的影響。填補豬流行性腹瀉感染機理方面的研究空白，為日后進行豬流行性腹瀉病毒的深入研究提供一定基礎。
　　1.豬流行性腹瀉病毒感染IPEC-J2細胞的病理變化
　　本試驗以vero細胞擴繁、TCID50為105.5/mL的PE

3、DV試驗材料，摸索合適的感染復數(shù)感染IPEC-J2細胞。以蔗糖密度梯度離心方法濃縮純化病毒，電鏡負染觀察病毒形態(tài)。見大量散在的、形態(tài)完整的病毒粒子，病毒粒子形態(tài)呈圓形、橢圓形、腎形和多邊形。以HE染色觀察感染PEDV的IPEC-J2細胞，發(fā)現(xiàn)細胞腫脹變圓、折光性加強，細胞內出現(xiàn)很多小空泡;伴隨空泡增多、逐漸合并形成大空泡，腫脹的細胞脫落、形成空隙;最終大量脫落的細胞碎片漂浮于細胞瓶中。RT-PCR方法檢測PEDV的增殖情況，在感染6h后

4、PEDV開始大量迅速增殖，12h達到最高峰，隨后病毒量逐步下降。電鏡觀察IPEC-J2細胞感染PEDV的超微結構變化，通過掃描電鏡觀察可見細胞微絨毛大量脫落消失、微絨毛頂端膨大變圓、可見數(shù)根融合形成蘑菇樣膨大。透射電鏡結果顯示微絨毛內部微絲束消失、細胞內部微絲束紊亂、線粒體空泡化嚴重，細胞核膜與病毒接觸部分出現(xiàn)溶解，未接觸部分核膜界限清晰。結果說明，病毒可以在IPEC-J2細胞上復制增殖，出現(xiàn)典型的空泡狀病變，同時引起微絨毛脫落與細胞內

5、部微絲骨架的紊亂。提示PEDV能夠引起細胞內部微絲骨架的改變。
　　2.豬流行性腹瀉病毒對緊密連接的影響
　　本試驗主要從細胞跨膜電阻的測定、腸上皮細胞旁路轉運試驗來研究PEDV對腸上皮細胞屏障的影響，間接反映緊密連接完整性;隨后通過檢測細胞緊密連接蛋白表達量來直接反映緊密連接的改變情況。PEDV感染IPEC-J2細胞的跨膜電阻值在感染后有短暫的上升，60min下降，直到12h電阻值再度高于正常對照組值。腸上皮細胞的細胞旁通

6、道轉運試驗顯示，隨著感染時間的延長，熒光滲透性標記分子在細胞旁路轉運量不斷加大，轉運率也逐漸增高。以Westernblot檢測PEDV對IPEC-J2細胞緊密連接蛋白表達量的影響，發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和粘附連接蛋白（E-cadherin）的表達發(fā)生了不同程度的變化。Claudin-1和ZO-1這兩種蛋白的表達量下調顯著。到了60min，除了E-cadherin的表達量基本正常外，其余三種蛋白

7、的表達量均下降到了正常表達量的85％左右。結果提示，PEDV的感染對緊密連接蛋白的表達量影響較小，而結合PEDV對微絲的影響極為顯著，我們推測，PEDV可能并不依賴緊密連接蛋白作為入侵受體，而是病毒引起微絲骨架的重組，誘發(fā)近微絲環(huán)的收縮，從而導致緊密連接蛋白的變動。
　　3.豬流行性腹瀉病毒與微絲骨架的相互作用
　　本試驗主要探討豬流行性腹瀉病毒在感染過程中與微絲骨架之間的關系。以FTTC-phalloidin染色法對感染后

8、的IPEC-J2細胞進行觀察后發(fā)現(xiàn)，微絲骨架感染后發(fā)生有規(guī)律的變化，我們人為地將微絲的變化劃分為五個不同時期:解聚一期(0-40min)，環(huán)膜期(60min)，解聚二期（80min-100min），環(huán)核期(6h-48h)，凋亡期(72h)。解聚一期，微絲開始解聚，微絲在細胞內呈現(xiàn)綠色霧狀;環(huán)膜期，部分微絲束開始恢復，在細胞膜下形成圍繞細胞的環(huán)狀高亮微絲束;解聚二期，微絲再次開始發(fā)生解聚，肌動蛋白彌散分布;環(huán)核期，微絲在細胞核附近堆積形成

9、散亂的斑塊，部分細胞在細胞膜下有一圈微絲形成的亮環(huán)，細胞間界限模糊;凋亡期，細胞大部分凋亡，脫落，殘存的細胞微絲聚集濃染，為典型的凋亡細胞染色特征。
　　以微絲穩(wěn)定劑(Jas)和細胞松弛素D(CytoD)改變細胞微絲的狀態(tài)，通過檢測細胞內病毒的TCID50來反映病毒的侵染情況。Jas和CytoD都能夠干擾PEDV入侵、復制和釋放，CytoD影響PEDV復制和釋放的效果更為顯著(P＜0.01)。
　　結果提示，在PEDV感染宿