熒光假單胞菌鞭毛蛋白對(duì)黑松細(xì)胞作用的轉(zhuǎn)錄組分析及黑松銀松素合酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、松材線蟲(chóng)攜帶的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens GcM5-1A）的鞭毛蛋白會(huì)引起黑松(Pinus thunbergii)細(xì)胞非典型性凋亡，為了從mRNA水平研究鞭毛蛋白對(duì)于黑松細(xì)胞的影響機(jī)制，本文使用鞭毛蛋白及去離子水分別處理黑松愈傷組織，通過(guò)Illumina solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)克隆從黑松體內(nèi)獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析得出的與銀松素合成酶mRNA高相似度的序列，并

2、進(jìn)行表達(dá)純化。結(jié)果表明:通過(guò)將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能比對(duì)，共有29，475個(gè)轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到功能分支上，這些功能包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。通過(guò)對(duì)兩樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)水平分析，得到差異表達(dá)顯著的轉(zhuǎn)錄本1779個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步GO分類和KEGG分析，共富集到286個(gè)GO功能分支以及11個(gè)代謝途徑上。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的上述分析，發(fā)現(xiàn)在黑松體內(nèi)存在的一些與抗病有關(guān)的基因在鞭毛蛋白的作用下顯著上調(diào)，包括以下基因編碼的酶，如蔗

3、糖合酶、銀松素合酶、幾丁質(zhì)酶、α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸氨裂解酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、過(guò)氧化物酶、WRKY1、PR5和PR10等。通過(guò)RT-PCR技術(shù)從黑松體內(nèi)克隆獲得了銀松素合成酶cDNA，將此序列克隆到表達(dá)載體pET-15b上，構(gòu)建pET-15b-PLS表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)構(gòu)建工程菌，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，重組銀松素合成酶在工程菌中得到高效表達(dá)，通過(guò)Ni2+螯合