豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素肺組織互作蛋白篩選研究.pdf

1、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素(Trimeric autotransporter adhesins，TAAs)是許多目前已知革蘭氏陰性菌外膜上具有的非常重要的黏附毒力蛋白，在細(xì)菌對機(jī)體的黏附過程、侵襲能力、定植作用、被膜形成、抵御血清和自凝功能中發(fā)揮非常重要的作用。黏附素通過與細(xì)胞表面基質(zhì)或受體結(jié)合后啟動(dòng)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)機(jī)體與致病菌互作，因此細(xì)菌黏附宿主在致病菌與宿主免疫系統(tǒng)互作過程中具有重要作用。Adh為APP上新發(fā)現(xiàn)的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素，

2、本文對Adh基因進(jìn)行肺組織文庫的酵母雙雜交篩選，并對篩選分析出的陽性蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，且利用生物信息學(xué)相關(guān)分析結(jié)果討論互作可能性及預(yù)測Adh其他未知功能。主要的研究內(nèi)容如下:
　　1.APP Adh基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
　　以NCBI公布的Adh基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物從APP5b型菌株中擴(kuò)增Adh基因，其基因大小為1600bp左右。將Adh基因連接T克隆載體，經(jīng)酶切測序鑒定正確后構(gòu)建PGBKT7-Adh重

3、組誘餌質(zhì)粒，該誘餌質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和測序驗(yàn)證顯示，插入的Adh基因序列無移碼突變，表明PGBKT7-Adh重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　首先將PGBKT7-Adh重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109感受態(tài)細(xì)胞中，篩選在SD/-Trp上能夠生長的酵母菌落作PCR鑒定，結(jié)果顯示1600bp左右條帶，表明PGBKT7-Adh重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)酵母菌AH109中，成功構(gòu)建含Adh基因的酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒菌。其次鑒定誘餌質(zhì)粒菌的篩選及生長特性，以空載體質(zhì)粒菌

4、為陰性對照，誘餌質(zhì)粒經(jīng)自激活驗(yàn)證試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)入的誘餌重組質(zhì)粒不能激活報(bào)告基因?qū)ψ陨頍o自激活現(xiàn)象，毒性驗(yàn)證表明誘餌質(zhì)粒菌與陰性對照生長情況一致對菌株的正常生長不產(chǎn)生影響，綜上結(jié)果說明誘餌質(zhì)粒菌能夠用于后續(xù)篩選驗(yàn)證。
　　2.肺組織文庫（大腸桿菌及酵母菌）質(zhì)量鑒定
　　將保存的肺組織文庫（大腸桿菌及酵母菌）平板培養(yǎng)后，首先分別挑取LB含氨芐抗性及SD/-Leu平板上的單個(gè)菌落作PCR鑒定文庫質(zhì)粒大小，結(jié)果顯示文庫條帶大部分分布于1

5、000bp左右，符合文庫片段大小要求。其次對肺組織文庫（大腸桿菌）容量進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示5ml的菌液總庫容量為2.9×107CFU。再對肺組織文庫（酵母菌）進(jìn)行滴度測定和缺陷培養(yǎng)基生長驗(yàn)證，缺陷培養(yǎng)結(jié)果顯示能夠在SD/-Leu平板生長，不能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板生長，說明表型正確;滴度結(jié)果顯示大于2×107 cfu/ml，表明文庫完整。結(jié)果表明保存的肺組織文庫（大腸桿菌和酵母菌）質(zhì)量

6、較好，能夠滿足酵母雙雜交篩選條件。
　　3.APP Adh肺組織互作蛋白篩選
　　將誘餌質(zhì)粒與保存的豬肺組織cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109中。根據(jù)酵母雙雜交篩選的缺陷生長及顯色原理，共轉(zhuǎn)子經(jīng)SD/-Trp/-Leu平板過度后轉(zhuǎn)移至SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板。挑取在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A上生長的藍(lán)色較大菌落，提取質(zhì)粒后與誘餌質(zhì)粒再次雜交作回復(fù)驗(yàn)證表明

7、具有顯色反應(yīng)。同時(shí)對質(zhì)粒進(jìn)行PCR及測序驗(yàn)證比對。結(jié)果顯示經(jīng)兩輪篩選，在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板上共獲得藍(lán)色較大酵母菌落13個(gè)，提取質(zhì)粒PCR結(jié)果顯示大部分質(zhì)粒位于500bp左右，測序驗(yàn)證后經(jīng)NCBI比對mRNA編碼區(qū)分析結(jié)果顯示篩選出四個(gè)陽性蛋白，分別為鋅指蛋白，含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，HLA-Ⅱ類分子的調(diào)節(jié)分子，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1。然后分析了四種蛋白的生物學(xué)特性及功能位點(diǎn)，