胸膜肺炎放線桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素序列分析及其黏附活性研究.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起豬傳染性胸膜肺炎疾病的病原菌，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并且是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病中重要的傳染病之一。2009年，Auger等進(jìn)行APp體外黏附豬肺上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新基因上調(diào)表達(dá)，與流感嗜血桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素Hsf 具有較高的同源性；在許多細(xì)菌中的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素具有一定的免疫保護(hù)作用，其中以自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素成功開(kāi)發(fā)出商品化的高效疫苗，最典型的是

2、百日咳桿菌的pertactin（PRN）作為一種疫苗組分添加，pertactin是疫苗產(chǎn)生抗體水平提高、減低百日咳感染的重要因素。因?yàn)锳PP中同樣具有三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素，所以嘗試?yán)冒偃湛鹊囊呙绨咐M(jìn)行研究。APP具有眾多血清型，其致病力和免疫原性各不相同，主要血清型間無(wú)免疫交叉保護(hù)，是制約APP致病機(jī)理和疫苗研究的瓶頸，嚴(yán)重影響了APP的診斷、檢疫和預(yù)防。為尋找有效的診斷、檢疫和預(yù)防的新方法，本研究選擇APP血清2、4、6、8、9、1

3、0型菌株為研究對(duì)象，以GenBank報(bào)道的APP血清5b型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素基因（CP000569.1，500018-510061bp）設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法尋找該基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析并預(yù)測(cè)各血清型三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素功能區(qū)，尋找到血清8型功能區(qū)完整，并將其功能區(qū)命名為adh基因進(jìn)行克隆與序列分析，對(duì)該adh基因進(jìn)行原核表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行昆明小鼠抗APP感染進(jìn)行免疫保護(hù)性測(cè)定，驗(yàn)證adh重組融合蛋白免疫保護(hù)性，并用凝血酶切除該重組融合蛋白的G

4、ST標(biāo)簽，純化Adh蛋白，并檢測(cè)Adh蛋白是否對(duì)豬肺上皮細(xì)胞具有黏附活性。結(jié)果表明，血清2、4、6、8、9、10型的自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的基因具有較大差異，發(fā)現(xiàn)血清8型與血清5b型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素氨基酸序列同源性達(dá)到92%，氨基酸推導(dǎo)序列同源達(dá)到82%；并成功獲得融合蛋白GST-8Adh，實(shí)驗(yàn)表明該蛋白及其抗體具有抑制APP對(duì)豬肺上皮細(xì)胞的黏附作用，并且對(duì)血清4、8型保護(hù)力達(dá)到9/10，對(duì)其他血清型保護(hù)不明顯，但也有一定的保護(hù)能力。本研究證明了AP