花生甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因(GPAT9)表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生是我國(guó)重要的油料作物之一，提高含油量對(duì)花生育種具有重要意義。植物貯藏油脂主要以三酰甘油(TAG)的形式存在于種子中，是由1分子甘油與3分子脂肪酸通過(guò)酯鍵相結(jié)合而成，是大多數(shù)生物中貯存能量和供給能量的主要形式。本研究構(gòu)建了花生甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（GPAT9)的表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑將其導(dǎo)入花生栽培種，獲得GPAT9過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)花生GPAT9基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建<

2、br>　　利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切重組質(zhì)粒pEASY-GPAT9和載體質(zhì)粒pGBVE，分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的DNA和載體DNA片段，用T4DNA連接酶將目的DNA片段與載體pG VE大片段連接，將重組DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，DNA測(cè)序結(jié)果表明攜帶AhGPAT9的過(guò)表達(dá)載體pGBV-G PA T9構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。
　　(2)花生GPAT9基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建
　　為了將目的基

3、因GPAT9反向插入表達(dá)載體中，在其上下游引物中引入NotⅠ和BamHⅠ識(shí)別序列，以pGBV-GPAT9為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得兩端帶有NotⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因，命名為RGPAT9，與載體pEASY-T1連接獲得pEASY-RGPAT9，重組質(zhì)粒pEASY-RGPAT9轉(zhuǎn)入大腸桿菌繁殖后，利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的基因片段，與植物表達(dá)載體質(zhì)粒pGBVE大片段連接，將重組DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，DN

4、A測(cè)序結(jié)果表明攜帶AhGPAT9的反義表達(dá)載體pGB V-RGPAT9構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。
　　(3)花生GPAT9基因的遺傳轉(zhuǎn)化
　　以花生栽培種豐花2號(hào)的胚小葉為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將GPAT9基因轉(zhuǎn)入花生中，共侵染外植體26703個(gè)，獲得1178株再生苗，篩選得到151株抗PPT的試管苗，PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性苗100株，其中27株生根，經(jīng)擴(kuò)繁煉苗后移栽大田。
　　(4)花生反義GPAT9基