稻米脂肪含量QTL分析及二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆.pdf

1、隨著水稻產(chǎn)量的基本穩(wěn)定和人民生活水平的不斷提高，人們對稻米品質(zhì)的要求也越來越高。食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)皆優(yōu)的稻米已經(jīng)成為水稻品質(zhì)育種的一個(gè)趨勢。脂肪是稻米重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，研究證明脂肪含量與稻米的食味品質(zhì)呈正相關(guān)。脂肪含量高的米蒸煮后，米飯表面油亮，且冷飯口感也不會(huì)降低。在一定范圍內(nèi)提高脂肪含量，可以改善米飯的香味，光澤度和適口性。因此，當(dāng)通過改良稻米的食味品質(zhì)指標(biāo)如直鏈淀粉含量，膠稠度和糊化溫度不能改善米飯口感時(shí)，可以通過提高稻米脂肪含

2、量來改良稻米的食味品質(zhì)。但是，目前對稻米脂肪的相關(guān)研究還很少，而且現(xiàn)有的研究都是對稻米脂肪含量進(jìn)行經(jīng)典的遺傳學(xué)分析和利用單個(gè)群體在單個(gè)環(huán)境下進(jìn)行QTL定位。有限的遺傳信息在一定程度上限制了利用分子手段改良稻米的脂肪含量，從而也制約了對稻米食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的分子設(shè)計(jì)育種進(jìn)程。為了對稻米脂肪含量的遺傳基礎(chǔ)有更全面的了解，更好地利用分子手段改良稻米油脂品質(zhì)，提高稻米的食味品質(zhì)，本文主要進(jìn)行了以下五個(gè)方面的研究： 1.利用BIL群體分

3、析不同環(huán)境中控制稻米脂肪含量的QTL 利用Nipponbare/Kasalath/Nipponbare回交重組自交系(BILs)作圖群體(BC<,1>F<,9>)和復(fù)合區(qū)間作圖QTL定位方法，分析2003年南京，2004年南京和2003年海南三個(gè)不同環(huán)境中糙米脂肪含量QTL的表達(dá)情況。在三個(gè)環(huán)境中，共檢測到7個(gè)控制脂肪含量的QTLs，分別位于第2、3、4、5和7染色體上，貢獻(xiàn)率變幅為5.48-23.17％。位于R3166-C24

4、9區(qū)間的qFC-5-1在2003年南京和2003年海南被檢測到，對表型的貢獻(xiàn)率分別為11.7％和17.43％，正加性效應(yīng)來源于親本Nipponbare等位基因。位于C847-R1789區(qū)間的印qFC-7，在2003年南京對表型的貢獻(xiàn)率為23.17％，是所有QTL中貢獻(xiàn)率最大的；在2004年南京對表型的貢獻(xiàn)率為7.50％，但是該QTL在兩個(gè)環(huán)境中遺傳效應(yīng)方向發(fā)生了改變。其它的QTL均是在一個(gè)環(huán)境中被檢測到，對表型的貢獻(xiàn)率都相對較少。

5、 2．利用RIL群體對不同環(huán)境乖發(fā)育時(shí)期控制稻米脂肪含量QTL進(jìn)行定位 以水稻雜交組合Asominori×IR24衍生的71個(gè)重組自交F<,10>家系為材料，在2005年南京灌漿初期(E1)、灌漿中期(E2)、灌漿末期(E3)和成熟期(E4)以及2004年南京成熟期(E5)和2003年海南成熟期(E6)6個(gè)環(huán)境對稻米脂肪含量進(jìn)行分析，利用復(fù)合區(qū)間作圖OTL定位方法共檢測到17個(gè)控制脂肪含量的QTLs，LOD值變幅為2.07-4

6、.45，對表型的貢獻(xiàn)率在7.2．17.38％之間，兩個(gè)親本中既有增效的等位基因也有減效的等位基因。其中qFC1-2和qFC-11-3可在兩個(gè)環(huán)境中檢測到，其它的OTL僅在一個(gè)環(huán)境中檢測到。四個(gè)發(fā)育時(shí)期，共檢測到11個(gè)控制脂肪含量的QTLs，對表型的貢獻(xiàn)率在7.2-14.19％之間，只有qFC-11-3可在兩個(gè)不同的灌漿時(shí)期檢測到，其它的QTL均是在一個(gè)時(shí)期檢測到。對三個(gè)不同地點(diǎn)成熟期的脂肪含量分析，共檢測到10個(gè)控制脂肪含量QTLs，所

7、解釋表型變異的貢獻(xiàn)率在9.36-17.38％之間，均是在一個(gè)環(huán)境中檢測到。結(jié)果表明控制脂肪含量QTL的表達(dá)具有較強(qiáng)的環(huán)境特異性和時(shí)空有序表達(dá)的特性，大多數(shù)QTL僅在一個(gè)環(huán)境中或一個(gè)發(fā)育時(shí)期檢測到。 3．水稻籽粒不同灌漿時(shí)期脂肪含量和脂肪指數(shù)的動(dòng)態(tài)QTL分析 利用由粳稻品種Asominori與秈稻品種IR24的雜交組合衍生的重組自交F<,10>家系(RIL)群體，采用非條件和條件QTL定位方法，對水稻籽粒灌漿四個(gè)時(shí)期的脂肪

8、含量(FC)和脂肪指數(shù)(FI)進(jìn)行分析。四個(gè)不同的灌漿時(shí)期共檢測到11個(gè)控制脂肪含量的非條件QTLs和10個(gè)控制脂肪含量的條件QTLs；11個(gè)控制脂肪指數(shù)的非條件QTLs和8個(gè)條件QTLs被檢測到。對脂肪含量和脂肪指數(shù)的非條件QTL分析中可以檢測到兩個(gè)灌漿時(shí)期同時(shí)表達(dá)的QTL；在條件QTL定位中，所有的QTL均在一個(gè)灌漿時(shí)間檢測到。灌漿前期，灌漿中期和灌漿后期檢測出較多的控制FC和FI的QTL。結(jié)果表明控制FC和FI的QTL的表達(dá)均具有

9、時(shí)空特異性。從整個(gè)灌漿時(shí)期對控制脂肪積累的遺傳因子進(jìn)行非條件和條件OTL分析，可以檢測更多的遺傳信息。與傳統(tǒng)的僅用一個(gè)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行定位的結(jié)果比較，不僅提高定位的效率，而且可以更全面地揭示控制稻米脂肪動(dòng)態(tài)積累的遺傳信息。 4．稻米脂肪合成途徑關(guān)鍵酶基因DGkT2的克隆和表達(dá)分析 根據(jù)水稻全基因組測序的信息設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法，從水稻中克隆了二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因2(DGA-T2)。對OsDGAT2推測的氨基酸序列

10、進(jìn)行分析表明：OsDGAT2編碼的蛋白質(zhì)序列與水稻中已知的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶序列同源性僅為17％；與水稻基因組測序后預(yù)測的一個(gè)具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶功能的序列同源性為77％。OsDGAT2與哺乳動(dòng)物，真菌和植物中已經(jīng)克隆的DGAT2同源性分析表明，OsDGAT2與油桐的DGAT2基因存在較高的同源性，為44％。OsDGAT2編碼蛋白具有一個(gè)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶保守的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)磷酸鹽?；D(zhuǎn)移酶保守的結(jié)構(gòu)域。通過蛋白質(zhì)序列功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)了

11、兩個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)可能與上述的磷酸鹽?；D(zhuǎn)移酶保守的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。該蛋白在水合特性上具有兩親性，有3個(gè)跨膜區(qū)。進(jìn)一步分離克隆了DsDGAT2的基因組DNA序列，具有9個(gè)外元，8個(gè)內(nèi)元。組織表達(dá)譜分析表明，OsDGAT2與水稻中另外兩個(gè)DGAT表達(dá)模式不同，OsDGAT2在各組織中都有表達(dá)，其中在莖，幼苗以及發(fā)育中期和成熟期種子中表達(dá)量最高。這些研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究OsDGAT2的功能及改良稻米油脂品質(zhì)，進(jìn)而改善稻米食味品

12、質(zhì)提供一定的理論指導(dǎo)。 5．建立了快速測量水稻脂肪含量的近紅外光譜分析方法 傳統(tǒng)的分析脂肪含量的方法存在速度慢和需要破碎樣品等缺點(diǎn)。近紅外光譜分析技術(shù)(NIRS)具分析速度快、無污染、不需破碎樣品、可同時(shí)分析多種組分等優(yōu)點(diǎn)，在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法不足。目前已經(jīng)在農(nóng)作物品質(zhì)育種、農(nóng)牧產(chǎn)品質(zhì)量分析、食品加工和品質(zhì)檢測等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用近紅外光譜(NIRS)分析技術(shù)和偏最小二乘法(PLS)建立了四個(gè)稻米脂肪定量分

13、析數(shù)學(xué)模型，并比較了糙米粒和糙米粉，精米粒和精米粉所建數(shù)學(xué)模型對預(yù)測稻米脂肪含量的效果差異。結(jié)果表明：在校正模型中，決定系數(shù)(R<'2>)分別為0.79，0.84，0.89和0.91，相應(yīng)的均方根差分別為0.16％，0.14％，0.09％和0.08％；在內(nèi)部交叉驗(yàn)證中R<'2>為0.73，0.81，0.81和0.89，相應(yīng)的均方根差分別為0.17％，0.15％，0.12％和0.09％；在外部交叉驗(yàn)證中R<'2>分別為0.62，0.80，