刺槐遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立及轉(zhuǎn)PpNHX1基因.pdf

1、刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又名洋槐，豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)刺槐屬(Robinia L.)，落葉喬木，它適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，材質(zhì)好，用途廣，繁殖容易，具有一定耐鹽堿性，因此成為人工造林優(yōu)選樹種。但是其有限的耐鹽能力限制了它在重鹽堿區(qū)的應(yīng)用。應(yīng)用基因工程技術(shù)提高刺槐的耐鹽性是拓展其用于重鹽堿區(qū)綠化、造林的重要途徑。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中公布的刺槐液泡膜上Na+/

2、H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，以鹽脅迫處理刺槐種子水培幼根誘導(dǎo)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)，由根總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA第一條鏈為模板克隆了RpNHX1基因編碼區(qū)序列，序列大小為1626bp，編碼542個(gè)氨基酸，通過酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建了用于刺槐遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體PBI121-RpNHX1并將其轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌LBA4404獲得用于刺槐遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌菌株。
　　試驗(yàn)選用刺槐耐鹽無性系W009為材料，建立了以形成層為

3、受體的刺槐遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。研究表明:以形成層為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為:1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖3％+水解乳蛋白100 mg/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)92.5％。最適宜愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.5 mg/L+IBA0.3mg/L+TDZ0.06 mg/L+蔗糖3％+水解乳蛋白100 mg/L+瓊脂6.5 g/L，分化率最高達(dá)到87.5％，平均每個(gè)外

4、植體產(chǎn)生不定芽數(shù)目7.7個(gè)。以帶芽莖段為外植體誘導(dǎo)叢生芽，以及華等(1993)研究為參考進(jìn)行了改進(jìn):MS+6-BA2.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+TDZ0.05mg/L+蔗糖5％+水解乳蛋白100 mg/L+AC0.5 g/L+瓊脂6.5 g/L，分化率為67.3％，平均每個(gè)外植體產(chǎn)生不定芽4.7個(gè)。當(dāng)產(chǎn)生的不定芽長(zhǎng)至2-3 cm時(shí)轉(zhuǎn)接到MS空白培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)壯后再接種到生根培養(yǎng)基上，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2

5、 mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖1.5％+AC0.5 g/L+瓊脂6.5 g/L，瓶苗生根率可達(dá)90％-100％。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)刺槐轉(zhuǎn)RpNHX1基因試驗(yàn)中，將預(yù)培養(yǎng)1-2d的形成層和帶芽莖段在活化好的農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染，侵染時(shí)間10 min，菌液濃度以重懸后OD600=0.6為宜，侵染后的外植體在不含抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，共培養(yǎng)基中加入50 mg/L乙酰丁香酮能提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。在研究不同抗生素對(duì)刺槐遺傳轉(zhuǎn)化受體

6、系統(tǒng)影響的試驗(yàn)中，確定了以刺槐形成層為受體時(shí)最佳抑菌劑種類及其濃度以及選擇劑的劑量方案，結(jié)果表明:抗生素Cef對(duì)外植體生長(zhǎng)抑制作用小，抑菌效果好，濃度為200mg/L時(shí)能完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。侵染后初次使用濃度為200 mg/L，隨繼代次數(shù)增加逐漸降低使用濃度直至完全除去。在誘導(dǎo)形成層愈傷組織分化的過程中添加100-125mg/L Kan能起到良好的篩選效果。侵染后的帶芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)添加200 mg/L Cef進(jìn)行抑菌，誘導(dǎo)分化不定芽