大豆Lea5基因的分析.pdf

1、胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant proteins, LEA蛋白)是一類多家族蛋白，它們?cè)诜N子胚胎發(fā)育的晚期豐富聚集，在整個(gè)生物界廣泛分布。LEA基因除組成型表達(dá)之外，還受到部分植物激素以及環(huán)境因素的誘導(dǎo)表達(dá)。許多研究已表明，LEA蛋白與植物的抗逆性關(guān)系密切，過(guò)表達(dá)LEA基因可以提高受體植物的抗逆性。煙草作為一種重要的模式生物，在研究其他植物 LEA基因功能時(shí)應(yīng)用十分普遍。
　　本次研究利用

2、差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRNA Differential Display PCR，即DDRT-PCR)與分子克隆方法從高溫處理的大豆幼胚中克隆到一個(gè)Lea基因。通過(guò)測(cè)序及生物信息學(xué)分析，基因表達(dá)的組織特異性，及其在不同胚齡胚中的表達(dá)分析探究該基因的功能。為進(jìn)一步探究大豆Lea5基因的功能，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把大豆Lea5基因轉(zhuǎn)入煙草，研究該基因的生物學(xué)功能，主要研究結(jié)果如下：
　　1.大豆Lea5基因的克隆與表達(dá)分析

3、　　(1)運(yùn)用DDRT-PCR技術(shù)和分子生物方法克隆得到大豆Lea5基因，該基因全長(zhǎng)449 bp，經(jīng)Blastp比對(duì)分析，大豆Lea5蛋白為L(zhǎng)EA-3亞家族成員，是由113個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為12.283 KDa，等電點(diǎn)為10.12，脂肪族氨基酸指數(shù)為89.646，不形成典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　(2)半定量RT-PCR分析表明，該基因在大豆幼胚中的表達(dá)不具有組織特異性；并且與組織的發(fā)育程度不相關(guān)。
　　2.

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆Lea5基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化
　　(1)構(gòu)建了pBI121-Lea5表達(dá)載體。
　　(2)煙草遺傳轉(zhuǎn)化。
　　以煙草葉盤為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用含有50mg/ L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基篩選抗性植株，并利用目的基因大豆Lea5基因與卡那霉素抗性基因NPTⅡ的PCR檢測(cè)，共獲得4個(gè)株系的轉(zhuǎn)大豆Lea5基因煙草。半定量RT-PCR分析轉(zhuǎn)Lea5基因煙草株系葉片中大豆Lea5基因的表達(dá)。不同轉(zhuǎn)基因株系中目的基