2014~2016年?yáng)|營(yíng)及鹽城地區(qū)野鳥與家禽中AIV監(jiān)測(cè)及其遺傳進(jìn)化研究.pdf

1、禽流感全名鳥禽類流行性感冒。禽流感病毒（Avain Influenza Virus，AIV）屬于正粘病毒科流感病毒屬。AIV全基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈RAN組成，分別為PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，和NS基因。目前已發(fā)現(xiàn)16種HA和9種NA，其互相組合形成了多種AIV亞型，如H9N2亞型、H5N1亞型。野鳥被認(rèn)為是AIV的天然宿主，但野鳥攜帶的禽流感病毒一般不直接感染人。近期我國(guó)爆發(fā)的新型H7N9和H10N8禽流感疫情嚴(yán)重威

2、脅公共健康，并給我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Chen et al.,2014)。研究表明，兩者均為低致病性AIV，其HA和NA的來(lái)源均與東亞-澳大利亞遷徙路線上的野鳥有關(guān)，而內(nèi)部基因來(lái)自家禽中流行的H9N2亞型AIV。因此，對(duì)我國(guó)遷徙候鳥及其棲息地區(qū)家禽中AIV的監(jiān)測(cè)、對(duì)野鳥和家禽攜帶的AIV的遺傳多樣性、對(duì)不同棲息地間AIV傳播的時(shí)空特征的研究工作具有重要的意義。
　　本研究以入選國(guó)際重要濕地名錄的黃河三角洲（山東東營(yíng)

3、）和江蘇鹽城濕地作為東亞-澳大利亞遷徙路徑上的北、南兩個(gè)研究基地，自2014年11月至2016年2月從兩研究基地共進(jìn)行了6次采樣，其中東營(yíng)和鹽城各采樣3次。共采集糞便、拭子等樣本6570份，其中家禽樣本3093份，野鳥樣本3477份。利用AIV通用型引物，TaqMan探針熒光定量PCR（Real-time PCR）方法檢測(cè)樣本中AIV陽(yáng)性率?；钋菔袌?chǎng)家禽樣本中AIV陽(yáng)性率為8.8％~35.0%（22/250~210/600），野鳥中 A

4、IV陽(yáng)性率為0.3%~9.4%（2/688~78/826）。利用普通PCR方法對(duì)Real-time PCR測(cè)得Ct值<30的樣本進(jìn)行H5亞型鑒定。將非H5亞型的樣本接種9~11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。H5亞型樣本送往國(guó)家疾控中心微生物所進(jìn)行病毒分離。共分離到29株H9N2、13株H5N1、2株H3N2、2株H5N2和2株H5N1+H3N2的混合感染毒株。其中除3株H9N2分離自鹽城外，其他毒株均來(lái)自東營(yíng)。除3株H9N2分離自東營(yíng)地區(qū)

5、野鳥外，其他均分離自家禽。并利用二代測(cè)序測(cè)得所有毒株的50個(gè)全基因組序列。自東營(yíng)的前兩次采樣中獲得25株AIV毒株。其中H9N2亞型占88%（22/25），H5N1亞型占4%（1/25）。而自東營(yíng)的第三次采樣中獲得的22個(gè)AIV毒株中H9N2亞型占18.2%（4/22），H5N1亞型毒株占63.6%（14/22）。這一數(shù)據(jù)說(shuō)明東營(yíng)地區(qū)的主要流行亞型可能由H9N2轉(zhuǎn)變?yōu)镠5N1亞型。選取上述分離自東營(yíng)的2株野鳥源、20株雞源和鹽城的3株雞

6、源株（共25株）H9N2亞型AIV全基因組，進(jìn)行了分子特征、系統(tǒng)發(fā)育及溯源分析。自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載每個(gè)毒株對(duì)應(yīng)的100條與其親緣關(guān)系最近的序列，用Muscle軟件將參考序列與本研究選取的序列對(duì)齊后，利用RAxML軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹。根據(jù)樹形與Bootstrap值對(duì)8個(gè)基因片段的進(jìn)化樹進(jìn)行了組別劃分，并根據(jù)這一劃分，最終將所述的25個(gè)AIV分為九個(gè)新的基因型。22個(gè)分離自東營(yíng)的毒株在這九個(gè)基因型中均有分布，這表明東營(yíng)地區(qū)的H9N2具有高

7、度的遺傳多樣性，說(shuō)明它們可能經(jīng)歷了頻繁的基因重配。此外，基因型6中的毒株內(nèi)部基因除一個(gè)毒株的PB2基因外其他均與基因型1（由分離自東營(yíng)的兩野鳥株組成）中的相同。這一證據(jù)可能暗示了病毒在野鳥與家禽之間的傳播。選取自東營(yíng)某養(yǎng)鴨場(chǎng)分離到一株鴨源H5N1亞型 AIV，將該毒株命名為A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1)，用以研究我國(guó)流行的H5N1高致病性AIV的進(jìn)化與傳播。對(duì)病毒HA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析表明其屬于2.3.

8、2.1c家系。根據(jù)其他基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，除了PB2基因來(lái)自于H9N2亞型外，其余7個(gè)基因均來(lái)自于H5N1。該毒株與北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三門峽野鳥疫情的毒株屬于同一個(gè)基因型，為2.3.2.1c中一個(gè)新近報(bào)道的基因型。并且該基因型病毒于不同時(shí)間點(diǎn)在我國(guó)的北京、山東和河南等地的家禽和野鳥中出現(xiàn)，表明其已具備了一定的適應(yīng)性并在持續(xù)傳播。尚未發(fā)現(xiàn)該基因型的毒株在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異。本研究為2014年11月至2