29676.藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白的生物合成及裂合酶催化功能的研究

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白的生物合成及裂合酶催化功能的研究姓名：張娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：環(huán)境科學(xué)指導(dǎo)教師：趙開(kāi)弘20091001II華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)合。加入與CpeT1和CpeS1同源的裂合酶輔助催化時(shí)，生成產(chǎn)物也為非天然產(chǎn)物，不能得到CpcB的天然色素蛋白。此外，在已有的體外重組條件下，摸索了pH值、二價(jià)金屬離子以及還原劑ME對(duì)CpeT1體外催化活性的影響，結(jié)果顯示，pH6.5~7.0時(shí)

2、裂合酶催化活性最好，二價(jià)金屬離子的加入并不能促進(jìn)酶反應(yīng)活性，大多數(shù)反而抑制反應(yīng)，去污劑和甘油的加入也會(huì)降低酶的生物活性。因此，CpeT1體外催化最佳反應(yīng)條件為500mmolLKPB150mmolLNaClpH7.2，不需加入其他輔助因子。在最佳重組體系中，裂合酶CpeT1催化CpcB得到色素蛋白的光譜圖與體內(nèi)重組產(chǎn)物相同，多酶的協(xié)助催化仍然不能生成天然產(chǎn)物。以上重組生成的色素蛋白經(jīng)圓二色譜檢測(cè)，結(jié)果顯示各色素蛋白在可見(jiàn)光區(qū)的構(gòu)象均與天然

3、色素蛋白相同，在紫外光區(qū)呈現(xiàn)天然藻膽蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)。裂合酶CpeT1經(jīng)特異性的化學(xué)劑修飾后，可以確定其功能氨基酸。修飾劑12環(huán)己二酮專一性修飾精氨酸，焦碳酸二乙酯修飾組氨酸，磷酸吡哆醛修飾賴氨酸，碳化二亞胺修飾羧基氨基酸?；瘜W(xué)修飾結(jié)果表明，精氨酸和組氨酸被修飾后活性降低，熒光和紫外吸收特征峰值發(fā)生改變；賴氨酸和羧基氨基酸被修飾后，重組產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相近，沒(méi)有發(fā)生變化。證明精氨酸和組氨酸可能是與裂合酶活性相關(guān)的氨基酸。同時(shí)，通過(guò)體內(nèi)重組

4、與體外重組的方法，判斷裂合酶His6CpeT1能否與藻藍(lán)色素PCB連接。體內(nèi)重組產(chǎn)物紫外吸收峰值為620nm左右，經(jīng)酸性尿素變性后變?yōu)?94nm，證明產(chǎn)物為游離色素，CpeT1在大腸桿菌體內(nèi)不連接色素PCB。體外重組產(chǎn)物紫外吸收峰值在619nm左右，變性洗脫后基本無(wú)色素產(chǎn)物，進(jìn)一步證明裂合酶CpeT1不能連接藻藍(lán)色素PCB，其酶催化機(jī)理將進(jìn)一步深入研究。CpeS1具有廣泛的催化活性，是藻藍(lán)蛋白中比較重要的裂合酶。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)，半胱氨

5、酸和精氨酸等氨基酸能影響CpeS1的生物活性。使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑peS1的51位和63位半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸，將18位、147位、169位分別突變?yōu)槔i氨酸、谷胺酰胺和亮氨酸。通過(guò)同源性比對(duì)，此五個(gè)氨基酸在同源的十余個(gè)蛋白中具有較高的同源性。同時(shí)，使用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件分析定點(diǎn)突變后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化情況。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，51位和147位氨基酸的突變導(dǎo)致了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，而其余幾位定點(diǎn)突變后的結(jié)構(gòu)變化微小。在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)出帶有