鹽藻6-4光裂合酶基因的功能鑒定及表達(dá)研究.pdf

1、紫外光照射可導(dǎo)致生物體在核酸水平上發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生致死性很強(qiáng)的嘧啶二聚體。其中6-4光產(chǎn)物(6-4 pyrimidine dimmer或6-4 photoproduct)的致突變性及致死性尤為突出<'[1]>，因?yàn)樗苯右鸺?xì)胞的凋亡；而CPD光產(chǎn)物(cyclobutane pyrimidine dimmer，CPD)僅僅造成細(xì)胞周期暫時(shí)或短期的停滯現(xiàn)象。因此，大力開展對(duì)6-4光裂合酶基因的研究與開發(fā)工作顯得極其重要。 鹽生杜

2、氏藻(Dunaliella salina)是一種耐鹽性極強(qiáng)的真核單細(xì)胞綠藻，它能在極端惡劣的環(huán)境中生長，并且具有較強(qiáng)的抗紫外能力。 本論文在實(shí)驗(yàn)室首次成功克隆得到鹽藻6-4光裂合酶基因Ds64PHR的基礎(chǔ)上，對(duì)Ds64PHR的紫外損傷修復(fù)特性、基因在核酸及蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況進(jìn)行了較為細(xì)致全面的研究與分析。 1、通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，完成了Ds64PHR在體內(nèi)的功能驗(yàn)證。將Ds64PHR轉(zhuǎn)入E.coliCPD缺陷型菌株SY

3、2，進(jìn)行基因在細(xì)胞體內(nèi)的抗紫外功能鑒定；將E.coliCPD光裂合酶基因轉(zhuǎn)入SY2中作為實(shí)驗(yàn)正對(duì)照，對(duì)Ds64PHR及E.coliCPD光裂合酶的修復(fù)能力進(jìn)行直觀的比較；將不含光裂合酶基因的空載體pET32轉(zhuǎn)入SY2中作為實(shí)驗(yàn)負(fù)對(duì)照，研究Ds64PHR自身的修復(fù)特性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：光修復(fù)過程對(duì)于提高細(xì)菌的存活來說是必需的；Ds64PHR基因表達(dá)的6-4光裂合酶對(duì)暴露在紫外線下嚴(yán)重受損的細(xì)胞具有一定的修復(fù)能力，能使SY2存活率提

4、高約1倍；E.coli CPD光裂合酶比Ds64PHR具有更強(qiáng)的修復(fù)活性，能使SY2的存活率提高約11倍；高強(qiáng)度的紫外線(0.5J/m<'2>)造成的損傷過于嚴(yán)重對(duì)生物體是強(qiáng)致死的，菌落存活率都已降到10<'-2>以下，CPD光裂合酶和6-4光裂合酶難以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)其加以修復(fù)；同時(shí)從實(shí)驗(yàn)的角度證明了Ds64PHR屬于6-4光裂合酶基因而非CPD光裂合酶基因。 2、完成了Ds64PHR基因的原核表達(dá)、純化以及條件的優(yōu)化。構(gòu)建pET

5、30a-Ds64PHR表達(dá)載體；將其轉(zhuǎn)入E coli BL21(DE3)進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)；通過洗滌包涵體的辦法純化Ds64PHR融合蛋白。 實(shí)驗(yàn)確立使用TYPG培養(yǎng)基，在1mmol/L的IPTG終濃度下37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h；通過SDS-PAGE分析證實(shí)產(chǎn)物大小為73kD，與目的蛋白大小相符；目的蛋白僅僅以不溶性的包涵體形式出現(xiàn)在細(xì)胞破碎后的沉淀重懸液中；最終通過緩沖液洗滌包涵體得到純凈的目的蛋白。 3、制備了Ds64PH

6、R的多克隆抗體。采用皮下多點(diǎn)注射方法，用純化的目的蛋白做抗原免疫兔子制備目的蛋白特異性的多克隆抗體。 通過雙向免疫擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)測(cè)定效價(jià)為1:32，特異性好；達(dá)到Western雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)多克隆抗體效價(jià)及特異性的要求。 4、研究了Ds64PHR在不同條件下的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)特性。通過Northern和Western雜交實(shí)驗(yàn)，選擇光照培養(yǎng)時(shí)間、紫外照射強(qiáng)度、黑暗條件誘導(dǎo)及高鹽環(huán)境脅迫為實(shí)驗(yàn)條件，以時(shí)間的變化為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，研究