玉米抗大斑病相關(guān)基因表達(dá)片段的分離和克隆.pdf

1、以含有抗大斑病不同主效抗病基因的玉米自交系(B37、B37Ht1、B37Ht2)為材料,利用DDRT-PCR技術(shù)對接種玉米大斑病菌(0號小種和1號小種)后玉米葉片早期表達(dá)基因進(jìn)行分析,以明確親和性互作與非親和性互作中差異表達(dá)基因的數(shù)目,并對可能與抗病性有關(guān)的差異表達(dá)片段進(jìn)行回收、克隆和測序,為建立玉米抗大斑病表達(dá)序列標(biāo)簽并最終克隆這些基因,研究其功能奠定基礎(chǔ).研究所獲主要結(jié)果如下:1、建立了適合玉米葉片mRNA差異顯示的技術(shù)體系(1)U

2、NIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取玉米葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在300bp-2000bp,適合于DDRT-PCR擴(kuò)增.(2)兩步擴(kuò)增法的PAGE檢測結(jié)果優(yōu)于一步擴(kuò)增法,帶型清晰,條帶數(shù)量也較多,每對引物可獲得擴(kuò)增條帶40-60條,大小為150-1000bp.2、用12個隨機(jī)引物、3個錨定引物組成的36個引物組合對接種(0號、1號小種)后的玉米葉片進(jìn)行DDRT-PCR擴(kuò)增,經(jīng)PAGE電泳和銀染檢測,共獲得差異顯示

3、片段148條,對其進(jìn)行回收,二次擴(kuò)增后,經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測,發(fā)現(xiàn)138條能再次產(chǎn)生擴(kuò)增條帶,差異片段回收率達(dá)93.2%.3、經(jīng)反式Northern雜交檢測,共獲得陽性片段63條,陽性率為42.6%.親和性互作中特異表達(dá)的基因片段為24條(其中可能與B37對0號小利感病有關(guān)的片段17條,可能與B37Ht1對1號小種感病性有關(guān)的片段7條);而非親和性互作中,特異表達(dá)的基因片段為21條(其中可能與B37Ht1、B37Ht2對0號小種抗病