23079.應用慢病毒載體介導rna干擾(rnai)技術研究雌鼠下丘腦nell2基因表達與gnrh基因表達的關系

1、上海交通大學碩士學位論文1第一部分第一部分大鼠大鼠NELL2基因基因RNAi慢病毒載體的構建及鑒定慢病毒載體的構建及鑒定前言RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一項新興的基因沉默技術，主要通過小干擾RNA（smallinterfereneeRNA，siRNA）和micrNA（miRNA）兩種小RNA分子來發(fā)揮作用。miRNA是一種大小約21～25bp的非編碼單鏈RNA，它的5′端有一磷酸基團，3′端為羥基，來自具有莖

2、環(huán)結構的前體（premiRNA）[1]。miRNA能夠有效的抑制目的基因的表達[2]，主要通過以下2種途徑：（1）不完全匹配，翻譯被抑制而不影響mRNA的穩(wěn)定性；（2）完全匹配，mRNA被切割進而下調基因表達。此外miRNA還可以通過指導其靶向基因的mRNA快速脫腺苷化，進而導致mRNA的快速衰減和表達水平的降低[3]。慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，具有可感染非分裂細胞和分裂期細胞，目的基因整合至靶基因組可以長期穩(wěn)定表達、免

3、疫反應小等特點，是一種比較理想的用于中樞神經系統基因研究的理想載體。慢病毒載體介RNAi就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNAi特異性抑制同源基因表達的作用相結合，充分發(fā)揮其高效、穩(wěn)定、特異性強等特點，同時利用它能在各類哺乳動物細胞、多種疾病的離體細胞以及不同動物在體細胞中實現穩(wěn)定的RNAi[47]抑制作用。自Stewart等[8]于2003年首次報道使用該技術后，該技術即被廣泛應用于疾病發(fā)病機理的研究。在本部分實驗我們利用分子生

4、物學技術完成大鼠NELL2micrNA慢病毒載體的構建以及病毒包裝，并擬在體外驗證病毒能夠有效感染細胞，為下一部分大鼠體內應用RNAi技術研究NELL2基因對GnRH基因表達及血清性激素水平的影響奠定基礎。上海交通大學碩士學位論文3MMLV逆轉錄酶、RNase抑制劑Promega，USAbactoyeastextractOxoid，Englbacto–tryptonOxoid，Engl瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Biomiga，USA高純

5、度質粒小提中量試劑盒天根生物公司T4polymeraseTakaRa，JapanPstI等限制性內切酶TakaRa，JapanNotI等限制性內切酶NEB，AmericaCIPTakaRa，Japan1.1.3實驗菌株、質粒實驗菌株、質粒大腸桿菌DH5α受體菌上海市兒童醫(yī)院遺傳所惠送pcDNA3.1()neoVectInvitrogenUSApGEMT載體TakaRa，Japan1.1.4主要試劑配制主要試劑配制溶液I（質粒提取）1M葡

6、萄糖2.5ml1MTris.Cl（pH8.0）0.5MEDTA（pH8.0)）1ml加H2O定容至50ml，高壓滅菌存4℃溶液II（質粒提?。?0MNaOH1ml10%SDS5ml，加H2O定容至50ml混勻，室溫存放溶液III（質粒提?。?4.73g乙酸鉀，5.75ml冰乙酸加H2O定容至50ml，4℃存放1.2實驗方法實驗方法1.2.1實驗流程實驗流程（1）將NELL2基因分三段分別擴增，相應的PCR產物（pNELL2I、pNELL