AgO2基因miRNA RNAi慢病毒表達(dá)載體與pEGFP-Cl-AgO2表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)血睪屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 我們?cè)谇捌谘芯恐型ㄟ^(guò)sertoli細(xì)胞與生精細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Argonaute2基因可能與血睪屏障相關(guān)基因claudin-11表達(dá)有關(guān)。為了深入研究相關(guān)機(jī)制,本課題設(shè)計(jì)構(gòu)建Ago2基因miRNA RNAi慢病毒表達(dá)載體與pEGFP-C1-Ago2表達(dá)載體,為研究其對(duì)血睪屏障相關(guān)基因claudin-11表達(dá)的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 提取小鼠睪丸組織中總RNA,采用RT-PCR的方法擴(kuò)增Ago

2、2基因編碼區(qū)全長(zhǎng),擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pEGFP-C1載體EcoRI、SalI位點(diǎn),獲得重組表達(dá)質(zhì)粒,并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定。應(yīng)用Lipofectamine(TM)2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染15P-1細(xì)胞,并通過(guò)RT-PCR及Western blotting法分別檢測(cè)Ago2基因及血睪屏障相關(guān)基因claudin-11基因和蛋白表達(dá)水平。以Ago2為靶向基因,利用www.maidesigner.invitrogen.com/rna1

3、iexpress在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)2對(duì)Ago2 miR RNAi序列,并將其克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體中,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后,用Lipotectamine(TM)2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染15P-1細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)Ago2表達(dá)情況,選擇干擾效果較強(qiáng)的質(zhì)?？寺≈罛LOCK-iTTM HiPerformTM Lentiviral PolⅡmiR RNAi ExpressionSystem,經(jīng)過(guò)氨芐青霉素和氯霉素篩選后

4、,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞中包裝慢病毒,轉(zhuǎn)染15P-1支持細(xì)胞,殺稻瘟菌素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,通過(guò)RT-PCR及Western blotting法分別檢測(cè)Ago2及血睪屏障相關(guān)基因claudin-11基因和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了pEGFP-C1-Ago2表達(dá)載體,可有效上調(diào)15P-1 sertoli細(xì)胞Ago2基因表達(dá),成功構(gòu)建了Ago2基因miRNA RNAi慢病毒表達(dá)載體,通過(guò)殺稻瘟菌素篩選,獲

5、得15P-1 Ago2-miRNA-RNAi穩(wěn)定株,可顯著下調(diào)Ago2基因表達(dá)。
　　 2.RT-PCR與western blotting結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Ago2表達(dá)載體上調(diào)claudin-11基因表達(dá)。相反,轉(zhuǎn)染Ago2-miRNA RNAi慢病毒下調(diào)claudin-11基因表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了Ago2基因pEGFP-C1-Ago2表達(dá)載體miRNA RNAi慢病毒表達(dá)載體