長期傳代的TGEV CN12株全基因組遺傳變異及qPCR檢測方法的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）引起的急性、高度接觸性腸道疾病，以仔豬嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征，是引發(fā)規(guī)模化豬場病毒性腹瀉的主要病原之一，不同品種和不同日齡的豬只均易感染，但2日齡內(nèi)的仔豬死亡率最高。成豬死亡率雖低，但會提高料肉比，增加飼養(yǎng)成本，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

2、該病于1946年在美國首次報道，此后迅速在許多國家發(fā)生和流行，我國在二十世紀(jì)60年代首次在臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，隨后陸續(xù)在大陸數(shù)省發(fā)現(xiàn)該病存在，近年來其危害程度日趨加深，嚴(yán)重影響了我國的養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。所以研究該病的流行與變異情況，并建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法是十分有必要的。
　　本研究利用PK-15細胞從華南地區(qū)某豬場腹瀉仔豬小腸病料中分離、鑒定為豬傳染性胃腸炎病毒，并命名為TGEV CN12株。該病毒經(jīng)PK-15細胞系體外連

3、續(xù)培養(yǎng)至120代，并對CN12株F5與F80兩代次進行全基因組序列的測定，利用生物軟件對測序結(jié)果進行處理與分析，為以后開展該病毒在致病性、診斷防控以及分子生物學(xué)方面的研究提供了一定的參考依據(jù)。
　　病毒分離鑒定結(jié)果顯示：CN12株在盲傳3代后開始出現(xiàn)比較明顯的細胞病變，隨著代次的增加，CPE出現(xiàn)時間縮短并趨于穩(wěn)定。測定其F5、F20、F40、F60、F80、F100、F120七個代次的TCID50分別為10-4.25/0.1mL、

4、10-5.23/0.1mL、10-5.67/0.1mL、10-5.89/0.1mL、10-6.67/0.1mL、10-7.33/0.1mL、10-7.26/0.1mL。序列分析發(fā)現(xiàn)：與國內(nèi)外TGEV參考毒株比較分析發(fā)現(xiàn)，CN12株在ORF3a基因上存在140個連續(xù)堿基的缺失，與華毒株（疫苗株）有明顯區(qū)分，可確定本分離毒株為野毒株，但它與華毒株H以及Miller株同源性較高，系統(tǒng)進化樹顯示親緣關(guān)系較近。與F5代次相比，CN12株F80在全

5、基因組上并未發(fā)現(xiàn)任何的插入、缺失等現(xiàn)象，只存在6個核苷酸的突變并導(dǎo)致4個氨基酸變異。
　　為了建立一種針對TGEV的快速、精確、敏感、簡便的檢測方法，本研究參考國內(nèi)外最新檢測技術(shù)研究的進展，設(shè)計一對TGEV S基因上的保守區(qū)引物，通過不斷的優(yōu)化反應(yīng)條件，初步建立了一套完善的TGEV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程式為Ct=-3.279 lgx+37.920，其中，R2=0.99845，E=1.0

6、2，表明試驗可信度高，反應(yīng)體系較好；熔解曲線的Tm值83.5～84.0℃之間，峰圖較為單一，并無非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)，表明本方法特異性比較高；特異性試驗結(jié)果顯示，只有TGEV出現(xiàn)熒光信號并呈現(xiàn)良好的擴增曲線，表明此方法特異性較好；本次試驗可以檢出的最低模板拷貝數(shù)達到25 copies/μL，比常規(guī)RT-PCR敏感度高約100倍；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗結(jié)果顯示的CV值均小于3％，表明本方法誤差小，重復(fù)性高；臨床樣品的檢測中，本方法檢出的陽性