遠(yuǎn)緣漸滲雜交引起的水稻基因組遺傳和表觀遺傳變異及其可能機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)室前期通過對預(yù)先選擇的一些基因片段的研究表明，菰漸滲可以誘導(dǎo)受體水稻基因組產(chǎn)生一系列遺傳和表觀遺傳變異。本實(shí)驗(yàn)首先通過采用甲基化敏感的擴(kuò)增片斷多態(tài)性（methylation—sensitive amplified polymorphism，MSAP）標(biāo)記方法，在全基因組范圍內(nèi)估測了三個(gè)漸滲雜交系（RZ1，RZ2和RZ35）相對于親本松前的甲基化變異程度和變異模式。共檢測了2700個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)代表一個(gè)同裂酶HpaII/MspI的識(shí)

2、別位點(diǎn)，根據(jù)這對同裂酶的不同酶切方式，估測在親本松前基因組有15．9％的5’—CCGG位點(diǎn)產(chǎn)生了內(nèi)側(cè)胞嘧啶的完全甲基化或者外側(cè)胞嘧啶的半甲基化，與水稻親本（松前）比較，這兩種甲基化修飾程度在所研究漸滲系中顯著提高，分別達(dá)到19．2％，18．6％，19．6％。以親本松前的MSAP擴(kuò)增圖譜作為對照，在漸滲系MSAP擴(kuò)增譜帶可以歸為四大類，每類又可以細(xì)分不同亞類。變化的甲基化模式包括5’—CCGG位點(diǎn)甲基化修飾程度的升高、甲基化的降低和內(nèi)外側(cè)

3、甲基化修飾模式的互換。大多數(shù)發(fā)生在低拷貝位點(diǎn)的變化可以被southern雜交的方法所證實(shí)，采用相同方法發(fā)現(xiàn)在同一漸滲系不同單株間這種變化是一致的。根據(jù)MSAP擴(kuò)增結(jié)果選擇了31條甲基化修飾模式在漸滲系不同于親本的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)這些序列分布于水稻不同12條染色體上，包括了編碼蛋白的基因，轉(zhuǎn)座子/反轉(zhuǎn)座及基因的非同源序列。 另外利用涵蓋水稻12條染色體和兩種細(xì)胞質(zhì)基因組的微衛(wèi)星（microsatellites，MS）序列對漸

4、滲系進(jìn)行了研究。微衛(wèi)星也稱作簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs），是在真核生物基因組廣泛存在的一種DNA序列，并且這種簡單重復(fù)序列存在很高的突變幾率。發(fā)現(xiàn)在所檢測的三個(gè)漸滲系的微衛(wèi)星位點(diǎn)均發(fā)生了大量相對于親本的遺傳變異，而且這種變異呈現(xiàn)一定規(guī)律，即在核基因組所有檢測的基因編碼區(qū)位點(diǎn)均表現(xiàn)出很高的保守性而在非編碼區(qū)位點(diǎn)漸滲系表現(xiàn)出較高變異性（基因間序列位點(diǎn)變異率達(dá)100％，5’端調(diào)節(jié)區(qū)為66．7％，內(nèi)含

5、子區(qū)占83．3％）。而且更意外的是，雖然是母系遺傳，在漸滲系細(xì)胞器基因組仍然檢測到了變異，這種變異甚至發(fā)生在基因編碼區(qū)。根據(jù)電泳圖譜，共有五類變異模式被檢測出來。通過對變異位點(diǎn)的序列分析，發(fā)現(xiàn)造成微衛(wèi)星位點(diǎn)變異的主要原因是微衛(wèi)星基序重復(fù)次數(shù)的改變，同時(shí)也有少量側(cè)翼序列也產(chǎn)生了變異。通常解釋微衛(wèi)星變異主要機(jī)制有染色體重組或基因轉(zhuǎn)換（gene conversion）及DNA復(fù)制滑移（DNA replication slippage）。但是無

6、論涉及到哪一種機(jī)制，糾正DNA復(fù)制錯(cuò)誤的錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因均在這些過程中起著重要作用。Real—time PCR分析顯示這些基因的表達(dá)均表現(xiàn)出相對于親本的不同變化，說明在漸滲過程中或其后幾個(gè)世代錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)發(fā)生了較大變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因啟動(dòng)子的DNA甲基化修飾也發(fā)生了一定改變，暗示DNA甲基化可能參與了錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)改變。最后對漸滲誘導(dǎo)的甲基化改變可能機(jī)制及在作物育種的意義及漸滲系是研究